紫外分光光度法测蛋白酶酶活.doc

紫外分光光度法测蛋白酶酶活1、原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。2、试剂和溶液2.1 三氯乙酸c（CCL3COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。2.2 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。2.3 盐酸溶液c（HCL）1 mol/L及0.1 mol/L1 mol/L H:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。0.1 mol/L H：取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。2.4 缓冲溶液a、磷酸缓冲液（pH7.5）适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO412H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。b、乳酸缓冲液（pH3.0）适用于酸性蛋白酶甲液 称取乳酸（8090）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。乙液 称取乳酸钠（70）16g，加水溶解并定容至1000 mL。使用溶液 取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。c、硼酸缓冲溶液（pH10.5）适用于碱性蛋白酶甲液 称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。乙液 称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。使用溶液 取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。2.5 10g/L酪素溶液称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸23滴）湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的H缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。2.6100ug/mLL酪氨酸标准溶液a、称取预先于105干燥至恒重的L酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60 mL溶解后定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。b、吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。3 仪器和设备3.1 恒温水浴400.2。3.2 紫外分光光度计 应符合GB 9721的规定。4 分析步骤4.1 求K值按下表配制不同浓度的L酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计于275nm测定其吸光度（A），以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）, 根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（g），即为吸光常数K值;（其K值应在（130135）范围内）。管 号酪氨酸标准溶液的浓度（g/mL）取100ug/mL酪氨酸标准溶液的体积 mL取水的体积mL吸光值Abs.0001011019220283303744046550554.2测定吸取适量稀释的酶液2.00mL、酪素2.00mL、三氯乙酸4.00 mL，其它操作条件同福林法测定中的反应、静止沉淀，直到过滤。滤液用紫外分光光度计，在275nm波长下，用10mm比色皿，测定其吸光度（A）。a、先将酷素溶液放入400.2恒温水浴中，预热5min；b、按下列程序操作：试管A（空白）试管B（酶试样，需作三个平行试样）加酶液2.00 mL 加酶液2.00 mL400.2，2min 400.2，2min加三氯乙酸4.00 mL（摇匀）加酪素2.00mL(已预热)（摇匀）400.2，10min（精确计时）400.2，10min（精确计时）加酪素2.00mL(已预热)（摇匀）加三氯乙酸4.00mL（摇匀）继续加热10min，过滤或离心继续加热10min，过滤或离心于275nm波长，测上清液吸光值 于275nm波长，测上清液吸光值c、1.398和166蛋白酶，除反应与显色温度为300.2外，其它操作同 4.2。标准曲线作同样处理。5 计算在40下每毫升酶液每分钟水解酪蛋白产生1g酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。XAK8/21/10nE2/5AKnE式中：X样品的酶活力，(u/mL)； A试样溶液的平均吸光度； K吸光常数； 8反应试剂的总体积，mL； 2吸取酶液2.00mL； 1/10反应时间10min，以1min计； n稀释倍数 E紫外法与福林法的换算系数（中性、碱性蛋白酶系数为0.50；酸性蛋白酶系数为0.77）。所得结果表示至整数。6结果的允许差平行试验测定值之差不得超过3。管 号酪氨酸标准溶液的浓度（g/mL）取100 ug/mL酪氨酸标准溶液的体积 （mL）取水的体积(mL)吸光值Abs.100100.000220280.138340460.308