紫外线对藻类抑制效果的研究.doc

紫外线对藻类抑制效果的研究摘要：以赤潮及压载水常见的7种藻为受试藻种，研究了紫外线照射对不同藻类的抑制效果以压载水常见的3种藻为受试藻种，将经紫外线照射的藻液分别放在黑暗条件下进行培养，研究了试验藻的光复活特性。结果表明1）紫外线照射对各种藻类的生长均有一定的抑制作用,不同藻在相同的紫外线剂量下灭活率不同。在照射剂量为60mJ/cm2时，梅尼小环藻的灭活率为82%，而镰形纤维藻的灭活率仅为47%。在光照培养条件下铜绿微囊藻最不易灭活，照射剂量为800mJ/cm2时，灭活率仅达73%。2）紫外线灭藻的效果还与藻细胞的形态有关系。尺寸较小的小球衣藻较易灭活，在照射剂量为20mJ/cm2时，小球衣藻的灭活率为50%，尺寸较大的镰形纤维藻的灭活率仅为30%。 3）经过紫外线照射的藻细胞具有自我修复的能力，这种修复能力随着照射剂量的提高而降低，但在照射后暗培养的条件下藻细胞几乎不能修复。4）镰形纤维藻、小球衣藻和盐生杜氏藻照射后暗培养，紫外线剂量为50mJ/cm2、100mJ/cm2、150mJ/cm2时，灭活率均在照射后的3天之内出现最大值。关键词：压载水 藻类 紫外线 灭活剂量船舶压载水所导致的外来生物入侵问题已经并且正在威胁着海洋环境、公共财产和人类健康，所以对压载水进行消毒是十分必要的。由于海洋生物对于化学残余物比较敏感，所以化学性消毒均存在一定的风险。国际海事组织（IMO）对压载水提出五项标准即安全、实用、经济、有效且环境容许。IMO公约规定压载水的排放标准为：小于50m但大于等于10m的可生存生物的浓度不大于10个/mL。一般认为介于这一粒径范围的可生存生物为各种藻类。因此为满足这一标准就需要研究藻类灭活技术。由于海洋生物对于化学残余物比较敏感，所以化学性消毒均存在一定的风险。紫外线消毒由于占地面积小、运行成本低、不产生消毒副产物及管理方便的优点，在水处理行业中逐渐受到人们的青睐。目前已经有不少关于紫外线灭藻的研究，均集中于湖泊富营养化中的常见藻类如铜绿微囊藻等，而对于赤潮及压载水带来的海洋生物入侵中常见的硅藻、绿藻等研究较少，尤其还未见“暗培养条件下紫外线照射对多种藻类灭活效果”的研究报道。因此本文分别对“光照和黑暗培养条件紫外线对多种藻灭活效果”进行研究，为紫外线灭藻在压载水处理中有着良好的应用前景。1 紫外线工作原理紫外线是波长在200400nm的电磁波，其中能杀菌消毒的紫外波段是200300nm。这一波段的紫外线照射微生物时，其体内的蛋白质、RNA和DNA能吸收紫外线。生物膜中蛋白质对紫外线的高吸收使得细胞膜被破坏，最终导致细胞死亡。当紫外线剂量较低时，DNA或某些病毒中的RNA吸收紫外线导致微生物不能复制。用于处理水中的藻类时紫外线所作用的主要靶分子包括核酸、蛋白质、膜质体、细胞骨架及光合作用系统等，主要基于以下几种机制：1）紫外线破坏蛋白质结构并使之变性；2）紫外线破坏核酸分子的结构，如引起胸腺嘧啶形成二聚体和DNA发生水合反应导致其死亡；3）损害细胞，抑制细胞活性；4）降解漂白细胞的色素，阻碍光合作用的顺利进行。2 材料与方法2.1 试验藻种及培养受试藻种如表1所示，均购于武汉水生生物研究所淡水藻种库。表1 受试藻种及其特征名称门形态（长度单位为m）培养基梅尼小环藻硅藻细胞近鼓形，1030119镰形纤维藻绿藻长纺锤形，2080SE卵形隐藻隐藻椭圆或长卵形，2080WC小球衣藻绿藻球形，819SE铜绿微囊藻蓝藻细胞球形或近球形，37BG11三角褐指藻硅藻细胞纺锤形，2535F/2盐生杜氏藻绿藻细胞呈梨形，1624F/2试验藻的培养基配方由武汉水生生物研究所淡水藻种库提供，用超纯水配制。藻种培养、转接、培养基配制均使用经过高压灭菌的玻璃器皿。各藻种均用光照培养箱进行培养，对于“照射后光照培养”的试验分两批进行。第一批包括4种藻：梅尼小环藻、小球衣藻、镰形纤维藻和铜绿微囊藻；第二批包括卵形隐藻、三角褐指藻和盐生杜氏藻。第一批培养光强7200lx, 第二批培养光强2400lx。其它培养条件均相同：温度23、每日光照14h即光暗比为14：10、手动摇藻1次/天。 “照射后黑暗培养”的试验藻包括镰形纤维藻、小球衣藻和盐生杜氏藻，照射后放入黑暗的生物培养箱中培养，温度22，光照对照样仍放在照射前的人工气候箱中培养，温度为23，光强为2400lx。2.2 紫外线照射源在微生物实验中，一般用紫外线准平行光束仪来测量某种微生物对紫外线照射的敏感性。紫外线准平行光束仪内装有1根40W低压紫外灯管，距离照射水样33cm。UV-B紫外辐照仪测定试验水样表面接受到的最大紫外线光强（254nm），分光光度计（型号UV-2401PC）测定试验水样的吸光度（254nm），根据紫外线照射试验的标准方法确定平均光强（），从而根据式（1）计算设计紫外线剂量（Dose）下所需的照射时间（）。 （1）取30mL试验藻液于直径90mm的培养皿中，放入转子，将培养皿置于紫外平行光束仪正下方，磁力搅拌器的上面，使藻液接受设计时间的紫外线照射。2.3 藻细胞计数用移液枪将藻液放在血球计数板的计数室中，在1040倍的显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（0.1mm3），所以可以根据在显微镜下观察到的藻细胞数目来换算单位体积内的藻细胞总数。2.4 紫外线照射对藻类生长抑制效果的评价方法经过紫外线照射后的试验藻每经过24h进行一次藻细胞浓度测定，由此得到不同紫外线剂量下藻细胞浓度与培养时间的关系曲线。以未经照射的藻样作为对照来计算藻的灭活率，其计算公式为： （2）式中未经照射的藻样中藻细胞个数紫外线照射一定时间后等量藻样中藻细胞个数3 结果与讨论3.1 光培养条件下紫外线对藻类灭活效果的研究将经过紫外线照射（最大紫外线光强介于0.140.19 mW/cm2之间）藻样分别放在光照培养箱中进行培养。选择长势良好的实验藻液，观察形态并计数。根据藻的种类及形态设定紫外线照射剂量，将经过照射的藻样放在光照培养箱中进行培养，每24h观察计数1次，研究在光培养条件下紫外线对7种实验藻的抑制效果。由图1可以看出，在强度固定的条件下（最大辐射强度为0.170 mW/cm2），紫外线照射对小球衣藻的生长有一定的抑制作用。经过紫外线照射后的藻液其细胞浓度在短时间内下降，在照射后的第3天（以照射当天为第1天计）照射后的藻细胞浓度又开始回升，且经过不同剂量的紫外线照射后其细胞浓度差异逐渐减小，这与已有的研究结果吻合，因为在一般的培养条件下，光复活和暗修复的协同作用使藻细胞又逐渐恢复活性。另外由空白对照组可以看出小球衣藻处于对数生长期（logarithm phras），这一时期的藻细胞代谢旺盛，具有更强的生命力和自我修复能力。因此从第3天开始，照射样与对照样的生长趋势一致。图1 不同紫外线剂量对小球衣藻生长状况的影响与小球衣藻类似，紫外线照射对其它6种试验藻的生长均有一定的抑制作用。经过紫外线照射后的藻液其细胞浓度在短时间内均下降后又开始回升，生长趋势与空白对照组基本一致。但是与各自的对照组相比，由于不同试验藻的种类、形态及生长期不同，紫外线照射对各种试验藻的抑制效果也不同。当试验藻细胞浓度逐渐恒定时，根据式（2）计算紫外线对试验藻类的灭活率。由表2可以看出，对于同一种藻，灭活率随着紫外线剂量的提高而增加。不同藻在相同的紫外线剂量下灭活率差异较大。铜绿微囊藻最不易灭活，在照射剂量为400mJ/cm2时灭活率仅为19%，这说明铜绿微囊藻这种蓝藻对紫外线有很强的抵抗力，这是由于其具有特殊结构的细胞壁的缘故。梅尼小环藻较易灭活，在照射剂量为60mJ/cm2时灭活率就达到了82%，这是由于梅尼小环藻藻细胞较小且处于延滞期的缘故，因为延滞期的藻细胞正处于恢复状态，其生理活性较低，抵抗外界干扰能力也相对较弱。卵形隐藻、铜绿微囊藻和三角褐指藻三种试验藻接受到的紫外线照射剂量相同，但是抑制效果均不同。相比较之下，对硅藻三角褐指藻的抑制效果要差一些。而对隐藻卵形隐藻和绿藻盐生杜氏藻的效果要好一些，尤其是在照射剂量较高时这种差别较大。这说明紫外线对藻类的灭活效果与藻的种类有关。而对于同属绿藻的镰形纤维藻和小球衣藻，在紫外线剂量相同的情况下灭活率也不同，相比较之下，对小球衣藻的抑制效果更好一些。这说明紫外线灭藻的效果与藻细胞的大小与形态有关。小球衣藻为球形，直径在819m之间，而镰形纤维藻的长度在2080m之间，而且为纺锤形，故更容易聚集，影响紫外光的透射，从而降低了抑制效果。表2 7种试验藻在不同照射剂量下的灭活率藻/UV剂量（mJ/cm2）2040608090120400600800梅尼小环藻29%78%82%小球衣藻50%52%58%63%镰形纤维藻30%38%47%58%盐生杜氏藻37%63%85%卵形隐藻32%70%77%三角褐指藻25%27%60%铜绿微囊藻19%53%73%3.2 暗培养条件下紫外线对藻类灭活效果的研究选择长势良好的3种绿藻：镰形纤维藻、小球衣藻和盐生杜氏藻进行试验。将照射后的藻液放在黑暗的生物培养箱中进行培养，每24h对试验藻进行细胞数量的测定。由图2可以看出，暗培养条件下对照样中的藻细胞浓度明显比光培养条件下对照样中的藻细胞浓度低，这是由在暗培养条件下，镰形纤维藻的光合作用受到抑制所致。经过紫外线照射后的藻液其细胞浓度迅速降低，在黑暗培养期间，镰形纤维藻由于没有光的催化作用使得光复活现象受到抑制，从而进行另一种可能的修复机制即暗修复。这一现象同以前的研究结果类似，暗修复作用不显著，藻液黑暗培养期间藻细胞数目变化不大。与镰形纤维藻类似，对于小球衣藻和盐生杜氏藻，暗培养条件下对照样中的藻细胞浓度明显比光培养条件下对照样中的藻细胞浓度低。对于盐生杜氏藻，未经照射的藻样在放进黑暗培养条件后细胞浓度迅速降低且逐渐趋于稳定，这可能是盐生杜氏藻对光照条件要求比较高，在不能满足光照条件的情况下藻细胞浓度即迅速降低的缘故。图2 暗培养条件下紫外线照射对镰形纤维藻生长状况的影响3种试验藻的灭活率随时间发生变化，但均在照射后的第3天达到最大灭活率，见表3。结果表明，在相同的试验条件下，小球衣藻最不易灭活，镰形纤维藻最易灭活。对于3种试验藻，紫外线剂量从100 mJ/cm2提高到150 mJ/cm2时，灭活率变化并不大，这说明试验藻接受紫外线照射可能存在着“剂量饱和”。表3 暗培养条件下3种试验藻的灭活率藻/UV剂量（mJ/cm2）50100150镰形纤维藻65%83%85%小球衣藻19%60%60%盐生杜氏藻74%76%84%4 结论紫外线照射对所有试验藻的生长均有一定的抑制作用，在光照培养条件下蓝