羊肚菌的多糖提取.docx

1材料与方法11供试菌种羊肚菌(Morchella esculenta)，本实验室保存。12培养基121斜面种子培养基：马铃薯200，蔗糖20，琼脂20，水1000mL，pH值自然。222 PDA加富培养基：马铃薯200，蔗糖20，KH2P04 015，MgS047H20 O15，琼脂2O，水1000 mL，pH值自然。123液体种子培养基：蔗糖2、蛋白胨01、酵母膏O5、KH2P04005、MgS04.7H20 005，pH值自然。241羊肚菌的液体培养将羊肚菌(M esculenta)菌种经斜面PDA培养基活化培养后，接种到装有PDA加富培养基的平皿中，置于25恒温培养箱中培养，直至长满。用无菌打孔器在长满菌丝体的平皿培养基上取一块约0.51.0 cm2的菌种块接入盛有100 mL液体种子培养基的250 mL三角瓶中，25、150rmin振荡培养72 h，243菌丝体生物量的测定发酵液经真空泵抽滤得到的沉淀物即为菌丝体，将菌丝体用蒸馏水反复洗涤后用四层纱布过滤，60C烘干至恒重，称重。按下式计算生物量：生物量(gL)=菌丝体干重(g)发酵液体积(mL)x 1000331提取与分离各种多糖的提取过程基本相同发酵菌丝体为原料，研究了羊肚菌菌丝体多糖的提取工艺：浸提温度90，浸提时间150 min，浸提比1：40，透析4到8 h，加入3倍95乙醇沉淀，沉淀物加入少许去离子水溶解，然后真空冷冻干燥即得粗多糖。李群(2000)报道，同一样品浓缩液加入3倍量以上的乙醇时即可使多糖完全析出。 244羊肚菌胞外多糖的提取取一定体积的去菌丝体发酵液加入3倍体积95乙醇，4静置24 h。3600 rmin离心10 min，弃去上清液。沉淀加入少量无水乙醇、乙醚、丙酮再离心，重复数次后收集沉淀，60热水溶解，真空冷冻干燥，得胞外粗多糖。332纯化与结构鉴定将粗多糖经Sevage法和三氯乙酸法脱蛋白，再经DEAE-Sephadex A一25柱层析纯化，用Sephadex G200凝胶层析和醋酸纤维膜电泳进行纯度鉴定，多糖的纯度达到98。2451多糖(硒多糖)的初步分离Sevag法脱蛋白Sevag法是利用蛋白质遇有机溶剂变性后不溶于水的特点而将其分离出去。Sevag法是经典的脱蛋白方法，条件较温和，但需反复5次左右才能除去大多数的蛋白质。粗多糖制品用60热水溶解，定容至一定体积加入l2体积的氯仿.正丁醇(体积比为2：1)混合液，振摇40min，静置分液，重复多次，至水相与有机相之间无白色沉淀时，离心，提取上层水相，浓缩，真空冷冻干燥，得脱蛋白粗多糖。H202脱色脱色方法采用H202脱色：将脱蛋白粗多糖溶于60热水，加浓氨水调pH至80，加20H202，45保温2-6h，然后用10 molL HCl调pH至70，抽滤，浓缩，真空冷冻干燥，得脱色素粗多糖。透析除小分子杂质将脱蛋白、脱色素粗多糖用60热水溶解，置透析袋中，4持续透析35 d，浓缩，真空冷冻干燥，得脱蛋白、脱色素、无小分子杂质的多糖。2443多糖的含量测定：苯酚硫酸法原理：苯酚硫酸试剂可与游离的或寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸(或甲苯衍生物)起显色反应，己糖在490 nm处(戊糖及糖醛酸在480 nm)有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。6苯酚溶液的配制称取6 g苯酚溶于100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，既得6苯酚溶液。将其置于棕色瓶中，避光保存。标准曲线制作：准确称取105干燥至恒重的标准葡萄糖01 g，加蒸馏水定容至100mL容量瓶，从中吸取10 mL再定容至100 mL容量瓶，即得100 ugmL的标准葡萄糖溶液。精密吸取标准溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0， 1.2 mL各以水补充至2.0 mL，加入6苯酚(6，新蒸)10 mL及浓硫酸50 mL，静置10分钟，摇匀，室温放置20min后，另精密量取2.0ml蒸馏水，同法操作，作为空白对照，可见分光光度计再490nm下测OD值，以OD值对葡萄糖的含量进行回归，得到回归方程。多糖含量()=c Xv1x0000 001m xV2x100式中：c从标准曲线上查得样品测定管中葡萄糖质量，ug：y l-样品提取时定容体积，mL：V2样品比色管中取样液体积，mL；m样品称量质量，ug。样品含量测定：吸取样品液10mL，按上述步骤操作，测DD值，以标准曲线计算多糖含量。注意：由于苯酚-硫酸法在测定过程中葡萄糖有脱水反应，温度不能过低，一般在室温20-30时测定十分稳定，另外，摇匀应充分。2471总抗氧化能力(T-AoC)采用普鲁士兰法(Oyaizu et a1，1986)：取l mL试样，加O2 M，pH66的磷酸缓冲液25 ml和质量分数1铁氰化钾(K3Fe(CN)6)溶液25ml，混合后在50放置20 min，取出后流水冷却，加入质量分数10三氯乙酸溶液25 ml混合，3000 rmin离心10 min后取混合液25 ml，加入25 ml蒸馏水和质量分数0.1氯化铁25 ml，混匀，静置10 min，以蒸馏水作为无还原能力的样品对照调零，在700 nm测定吸光度。吸光度越高，抗氧化性越好，还原力越强2472 清除羟自由基(OH)邻二氮菲Fe2+氧化法(赵艳红等，2008)：吸取15 mL 5 mmolL邻二氮菲应用液，加入4 mL pH 74(075 molL)磷酸钠缓冲液，充分混匀。再加入l mL 75 mmolL FeS04溶液，立即混匀。加入l mL某一浓度的样品溶液，立即混匀。加入15 mL双蒸水，以补充体积。最后加入10 mLlH202溶液，以双蒸水代替H202溶液作为空白对照，轻轻混匀。37，保温90 min。于536 nm测定吸光度。羟自由基清除率计算公式：OH清除率()=(A加药一A过氯化氢)(A未损一A过氧化氢)100式中，A加药为加入样品(抗氧化剂)及H202A损伤为=加H202而不加抗氧化剂A未损为两者都不加274-3清除超氧阴离子自由基(02)用光照核黄素体系产生超氧阴离子自由基02，NBT法检N(Stewar2474清除DPPH自由基将不同浓度的多糖溶液2 mL与2 mL 210-4molL DPPH