木瓜蛋白酶1448551.doc

食品添加剂 木瓜蛋白酶 学 院:食品与营养工程学院 专 业:食品加工 班 级:食工102 学 号:0101101222 姓 名:王瑞真 木瓜蛋白酶 木瓜蛋白酶又称木瓜酶，是一类疏基蛋白酶。广泛存在与番木瓜的根、茎、叶和果实内，在未成熟的乳汁中含量最丰富。它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特色，因此在食品、医药、饲料、皮革及纺织等行业得到广泛应用1。一、木瓜蛋白的组分 工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。由木瓜乳胶提取粗制酶,除含有木瓜蛋白酶外,还含有半耽氨酸蛋白酶、纤维素酶、溶菌酶、谷氨酞胺以及低相对分子质量的疏基化合物,还有葡萄糖酶等。其中大部分都是疏基蛋白酶,主要的两种组分是木瓜凝乳酶和木瓜蛋白酶2。二、木瓜蛋白的结构木瓜乳汁中四种已知半肤氨酸蛋白酶的一级结构具有高度同源性,其氨基酸数目和同源性比较如表1所示。除chymopapain含有8个半肤氨酸外,其余三种酶都只含有7个半肤氨酸。25位的流基是活性位点,不参与二硫键的形成（chymopapain的117位琉基也不参与二硫键的形成）,其余疏基以相同的方式形成三个二硫键，具有同样的保守性。人们在不同清晰下得到了四种酶的X一射线结构。四种酶的肤链折叠方式相似,形成两个大小相、构型不同的区域。一个是由a一螺旋构成的L一区,另一个是由大量反向平行的片层构成的R一区。活性位点氨基酸残基Cys25,Asn179和His159 就位于这些区域的表面,其中Cys25位于L一区,起始a一螺旋上。木瓜蛋白酶家族的Cys25，Gly23，Gly65形成的S。亚部位是一个大口袋，对底物专一性影响较小；S亚部位由于酶不同其氨基酸组成不同,几何形状亦不同,对酶的性质影响较大3。三、木瓜蛋白酶的提取工艺1.过去的常规提取方法 木瓜蛋白酶最原始的提取方法是烘干法，就是在番木瓜浆液中加入保护剂，然后将浆液离心取上清液放置于鼓风干燥箱中，在5560烘干，粉碎后即得到粗酶制品。乙引等用这种方法所获得的酶得率为23.1%，但此法不利于酶活的保持，其酶活力仅为0.16105U/g，而且产品的纯度较低4。 木瓜蛋白酶的提取也曾广泛采用单宁沉淀法，乙引等用单宁沉淀法提取了木瓜蛋白酶。先将番木瓜乳汁离心，于上清液中缓慢加入已溶解的单宁溶液，不断搅拌，使溶液中单宁达到一定浓度。静置，沉淀单宁-酶复合物，调节pH值，沉淀后进行真空干燥，得到酶制品。结果表明，这种方法生产的酶得率较低，仅有7.3%，但酶活力较高，为3.53105U/g。但是这种方法存在环境污染等问题。2.目前较为常见的提取方法 目前生产中多采用超滤、絮凝、盐析等方法分离提取木瓜蛋白酶。2.1 超滤法提取木瓜蛋白酶 刘叶青等用超滤技术纯化木瓜蛋白酶。先将中空纤维超滤膜洗净, 然后取一定量絮凝处理后之清液, 控制一定压力和流量, 进行超滤。在超滤过程中被截留, 而水及小分子杂质透过膜, 从而达到浓缩和纯化的目的, 试验截留率可达93% 以上。超滤过程操作条件温和, 无相变化，不易引起生化物质破坏, 是一种较好的分离技术5。2.2 盐析法提取木瓜蛋白酶 王丽彬等曾用硫酸铵沉淀法分离木瓜蛋白酶。在粗酶液中加入一定浓度的硫酸铵溶液进行盐析，然后调pH值，离心取沉淀，干燥，得酶产品。实验结果表明，用该法制备的木瓜蛋酶纯度相对较高，酶的比活力达到了1184U/mg，适宜作为化妆品成分。但这种方法由于用了大量的盐，使酶中灰分增加，同时降低了木瓜蛋白酶的活性。因此，盐析法并不是理想的木瓜蛋白酶提取方法6。2.3絮凝法分离纯化木瓜蛋白酶絮凝法是在木瓜乳胶水提取液中添加某种化合物，该化合物能与木瓜蛋白酶生成难溶性的复合物，从而使酶从溶液中沉淀析出。何继等研究了用絮凝技术纯化木瓜蛋白酶。实验结果表明，在适宜的条件下进行絮凝处理，可使木瓜蛋白酶在这步的收率达9597%。但这种方法提取专一性不强，制得的木瓜蛋白酶纯度不高，杂质含量较高7。3木瓜蛋白酶的提取新技术3.1超声波法提取木瓜蛋白酶 超声波提取法作为一种新型的提取技术已经比较广泛地应用于天然植物有效成分的提取。超声波产生的空化效应，一方面赋予溶剂对细胞壁更大的渗透力，并强化细胞内外的质量传输，另一方面破坏细胞壁，使细胞内含物更易释放，从而强化了提取过程。4. 木瓜蛋白酶的固定化研究固定化酶是近代生物技术的重要手段,利用不同载体制备固定化木瓜蛋白酶,可以大大节约用酶,并能反复利用.目前国外已开始在酿造、牛奶加工等多种领域中广泛应用。我国在这一领域尚处于试验阶段。大力开发固定化木瓜蛋白酶的系列产品,已成为当务之急8。酶的固定化方法主要有: 吸附法、包埋法、共价键结合法、交联法等。这些方法各有利弊。载体材料作为固定化酶的重要部分, 其结构和性能对固定化酶的酶学性质产生很大的影响9。四、木瓜蛋白酶的应用进展 木瓜蛋白酶具有较强的蛋白酶水解能力，还具有凝乳、解脂和溶菌活力，是能作用与各类蛋白质的纯天然产物。具有耐高温、活性强、稳定性好、蛋白质水解能力强等特性，对PH变化和金属离子及去垢剂不敏感，用途很多，目前已广泛的应用于各个行业。1.在食品行业的应用1.1 肉类嫩化 在肉类加工中，木瓜蛋白酶是最好的肉类嫩化剂10，这是因为木瓜蛋白酶与其他蛋白酶相比，其热稳定性较高。一般蛋白酶在较低温度时即失活，而肉类结缔组织中胶原蛋白和弹性蛋白在60度以上开始变性，并变的容易被木瓜蛋白酶降解，而且70度断裂最多，木瓜蛋白酶对肉类在40-70度温度范围内有最强的活性，而嫩化作用主要发生在当肉类被烧煮，温度逐渐升高，而酶还没有完全失活这个阶段。所以在肉类嫩化中，使用最多的是木瓜蛋白酶。1.2改良啤酒品质 采用木瓜蛋白酶处理冷冻贮存过程中的啤酒，能有效防止冷冻浑浊的形成，保证啤酒的高清晰度和良好的外观，提高啤酒泡沫覆盖度；同时，还可以提高啤酒的营养价值。当木瓜蛋白酶的浓度为0.08mg/(100ml)时，对啤酒的澄清效果最佳，并能够改变各种游离氨基酸的含量，除His和Pro外，所以氨基酸含量均有不同程度增加。因此木瓜蛋白酶可用作啤酒的澄清剂、稳定剂，并可改善啤酒的营养成分11。1.3处理葡萄酒中非稳定性蛋白 利用木瓜蛋白酶水解白葡萄酒中的不稳定蛋白，以提高葡萄酒的稳定性，同时增加酒的营养价值 通过查阅大量文献及参考实际生产情况，采用测定酶处理后的白葡萄酒中的蛋白质含量来确定最佳酶反应条件木瓜蛋白酶可以对影响葡萄酒稳定性的蛋白质进行水解，来解决白葡萄酒的稳定性12。1.3松化饼干 以木瓜蛋白酶为主要成分的饼干松化剂，能降低面团筋度、提高饼干疏松度、成形性好、花纹清晰、碎饼率低，成品光泽度增加。饼干质地疏松，口感舒适，此外还可减少油脂和糖的用量。适合各种风味的高、中、低档饼干、糕点及面包的制造。1.4改性豆类制品 大豆蛋白营养价值较高，其中必须氨基酸含量在植物蛋白中较为合理，采用木瓜蛋白酶可以提高大豆分离蛋白的水解作用，克服了一般酶水解法效率较低、易失活的不足，且改性产品口味较好。木瓜蛋白酶在特定条件下，体系中游离氨基酸和蛋白质表面疏水性发生变化，在大豆蛋白质凝固的反应中起重要作用，可促进豆腐凝胶的形成13。1.5在饮料制作中的应用 张驰等利用木瓜蛋白酶进行莼菜饮料的研制，莼菜一定温度烫漂杀青一定时间后搅碎打浆，用一定浓度的Vc护色，以木瓜蛋白酶作用于莼菜浆液一定时间，以加倍水进行沸水浴提取一定时间，调配后可制成具有良好风味和优良品质的莼菜饮料。1.6提高谷朊粉乳化性 实验证明14木瓜蛋白酶对谷朊粉的乳化性和溶解度的提高有显著作用，最佳条件为：谷朊粉质量分数为11.0%，酶浓度为25uL/g谷朊粉，反应时间为20h,pH为7.0，反应温度为55度。在此条件下测得的改性谷朊粉的乳化活性为72.4%，乳化稳定性为75.5%，水解度为3.5%。1.7用于营养保健品 木瓜蛋白酶用于保健食品的一种途径是辅助消化, 另一种途径是将蚂蚁等昆虫的特殊蛋白源食品分解制成各种营养保健液15。1.8木瓜蛋白酶水解玉米胚芽蛋白 张鸣镝等利用胰蛋白酶水解玉米胚芽蛋白,水解度为1014%。利用木瓜蛋白酶对玉米胚芽蛋白进行水解,可使其变成可溶的肽类而被提取出来,水解度较高且制得的水解液无苦味16。2、 在化学方面的应用2.1促进中药成分煎出 用木瓜蛋白酶预处理补骨脂粉后煎提,与普通煎煮法比较，煎液总氮量提高了2倍，磷脂提高了4倍，补骨脂素、异补骨脂素提高了近1倍。结果提示，蛋白酶水解蛋白质的同时，促进了磷脂的溶出，发挥增溶作用，最终导致各种有效成分煎出量增加17。2.2降解壳聚糖 壳聚糖是年产量仅次于纤维素的第二大天然高分子，低壳聚糖是壳聚糖的降解产物，它有独特、优越的生于活性和理化性质。木瓜蛋白酶价格便宜且稳定性好，对壳聚糖的降解效率很高。结果表明18测定木瓜蛋白酶降解壳聚糖的较佳条件是底物浓度0. 5%、pH4. 0、40,酶底物比10%。在最适条件下木瓜蛋白酶降解壳聚糖时,起始降解速率很快,特别在30min内导致粘度下降百分比达到70. 77%, 1h之后粘度变化平缓19。 3. 在医疗方面的应用3.1医药方面3.1.1治疗皮肤溃疡 可以清除挫伤、切断伤、烧烫伤等各种皮肤表面的溃疡，可以有效去除腐烂组织而防止皮肤的感染，而对健康组织无影响20。3.1.2辅助Rh血型的鉴定 用木瓜蛋白酶法对Rh血型的抗D、抗E抗体等的免疫初期具有良好的检出力。在木瓜蛋白酶交叉配血中发现了1例木瓜蛋白酶型抗C、抗E抗体。3.1.3建立关节炎实验模型 将木管蛋白酶注入新西兰大鼠的关节内，经连续三次注射，大鼠的关节在12周内出现了慢性关节炎的症状。3.2兽医方面华南农业大学与广西亚热带作物研究所协作，用木瓜蛋白酶、抗菌素和凡士林作膏剂，对百多例深层蹄心部化脓性外伤的奶牛进行治疗，酶将严重阻隔药物进入的疮痂分解，令抗菌素直接接触及创面细菌，治愈了广州朱村奶牛场病患达几个月的顽固蹄腐病牛，开创了木瓜蛋白酶兽药的先河7。在其他方面的应用4.1在纺织工业中的应用 由于木瓜蛋白酶只溶解丝胶而对纤维蛋白全无作用，所以能令丝织物等滑爽柔软。4.2在化妆品工业方面 木瓜蛋白酶有溶解死细胞的能力，加入化妆品可消除黑斑、雀斑，有美化肌肤的功效;可处理坏死组织和伤疤、治疗粉刺、脱毛和皮肤净化。五展望目前，木瓜蛋白酶被广泛地应用于食品行业，如肉类、啤酒、调味品等的生产。随着我国人民生活水平的提高，人们对食品安全和食品营养的问题越来越注，而木瓜蛋白酶可用来生产安全、营养的食品，如具有保健功能的口服液等，具有良好的市场前景。同时，为了满足各行各业对木瓜蛋白酶的需求，尤其是食品与医药行业，研究如何分离纯化得到成本低、纯度高的木瓜蛋白酶就很有意义。因此，对木瓜蛋白酶的提取和分离纯化技术进行深入的研究，提取高质量的木瓜蛋白酶具有重要的实用价值6。参考文献1. 万婧等. 乙醇提取海南番木管蛋白酶的工艺研究. 食品科技，20102. 熊华. 木管蛋白酶应用研究进展. 西华大学生物工程学院. 20063. 惠丽娟. 木管蛋白酶的研究进展. 中国西部科技. 20074. 刘凤瑶等. 木瓜蛋白酶与菠萝蛋白酶的产业开发. 食品工业科技. 20085. 何继芹等. 木瓜蛋白酶的分离方法及其应用进展. 食品科技. 20066. 赵电波等. 木瓜蛋白酶的提取及应用研究进展. 肉类研究. 20117. 沈悦. 番木瓜蛋白酶研究与应用综述. 科技信息. 20088. 吴显荣. 木管蛋白酶的开发与应用. 中国农业大学学报. 20059. 何平等. 木瓜蛋白酶的固定及其性质研究. 热带亚热带植物学报. 200810. 蔡晓雯等. 肉的嫩化与番木管蛋白酶. 肉类研究. 200311. 乙引等. 木瓜蛋白酶改良啤酒品质的研究. 贵州农业科学. 200012. 张传军. 木瓜蛋白酶处理葡萄酒中非稳定性蛋白的研究. 食品研究与开发. 201013. 杨欣等. 木棺蛋白酶中主要组分凝固大豆蛋白的特性. 食品与生物技术学报. 200514. 赵冬艳等. 木瓜蛋白酶提高谷朊粉乳化性德研究. 粮食与饲料工业. 200515. 熊琼超等