蛋白质化学-期末复习2.pdf

第七章 生物传感器第七章 生物传感器 定义定义 传感器传感器 能感受 或响应 一种信息并变换成可测 量信号 一般指电学量 的器件 生物传感器生物传感器 将生物体的成份 酶 抗原 抗 体 将生物体的成份 酶 抗原 抗 体 DNA 激素 或生物体本身 细胞 细胞器 组织 固定化在一器件上作为敏感元件的传感器称 为生物传感器 激素 或生物体本身 细胞 细胞器 组织 固定化在一器件上作为敏感元件的传感器称 为生物传感器 生物传感器的基本组成生物传感器的基本组成生物传感器的基本组成 生物传感器的基本组成 敏感元件 分子识别元件 和信号转换器件敏感元件 分子识别元件 和信号转换器件敏感元件 分子识别元件 和信号转换器件敏感元件 分子识别元件 和信号转换器件 生物传感器的工作原理生物传感器的工作原理 1 将化学信号转变成电信号 已经研究的大部分生物传感器的工作原理均属 这种类型 例如酶传感器 酶催化特定底物发生 反应 从而产生一种新的可供测量的物质 用能 把这种物质的量转变为电信号的装置和固定化的 酶相耦合 即称为酶传感器酶传感器 2 将热能变化转换为电信号 3 将光效应转换为电信号 4 直接产生电信号 4 生物传感器的分类4 生物传感器的分类 1 根据生物传感器的输出信号方式分类 1 根据生物传感器的输出信号方式分类 a 生物亲合型传感器 生物亲合型传感器 被测物质与分子识别元件上的敏感物质具有生物亲合作 用 即二者能特异地相结合 同时引起敏感材料的分子 被测物质与分子识别元件上的敏感物质具有生物亲合作 用 即二者能特异地相结合 同时引起敏感材料的分子 结构和 或固定介质结构和 或固定介质发生变化 例如 电荷 温度 光学 性质等的变化 反应式可表示为 发生变化 例如 电荷 温度 光学 性质等的变化 反应式可表示为 S 底物 底物 R 受体 受体 SR b 代谢型或催化型传感器 代谢型或催化型传感器 另一类是底物 被测物 与分子识别元件上的敏感物 质相作用并生成产物 信号转换器将底物的消耗或产 另一类是底物 被测物 与分子识别元件上的敏感物 质相作用并生成产物 信号转换器将底物的消耗或产 物的增加转变为输出信号物的增加转变为输出信号 这类传感器称为代谢型或 催化型传感器 其反应形式可表示为 这类传感器称为代谢型或 催化型传感器 其反应形式可表示为 S 底物底物 R 受体受体 SR P 生成物生成物 2 根据生物传感器中分子识别元件上的敏感 物质分类 2 根据生物传感器中分子识别元件上的敏感 物质分类 生物传感器中分子识别元件上所用的敏感物质有生物传感器中分子识别元件上所用的敏感物质有酶 微生物 动植物组织 细胞器 抗原和抗体 酶 微生物 动植物组织 细胞器 抗原和抗体等 根 据所用的敏感物质可将生物传感器分为酶传感器 微生物传感器 组织传感器 细胞器传感器 免疫 传感器 基因传感器等 等 根 据所用的敏感物质可将生物传感器分为酶传感器 微生物传感器 组织传感器 细胞器传感器 免疫 传感器 基因传感器等 3 根据生物传感器的信号转换器分类 3 根据生物传感器的信号转换器分类 生物传感器的信号转换器有 电化学电极 离 子敏场效应晶体管 热敏电阻 光电转换器等 据此又将生物传感器分为电化学生物传感器 半 导体生物传感器 测热型生物传感器 测光型生 传感器 测声型生物传感器等 生物传感器的信号转换器有 电化学电极 离 子敏场效应晶体管 热敏电阻 光电转换器等 据此又将生物传感器分为电化学生物传感器 半 导体生物传感器 测热型生物传感器 测光型生 传感器 测声型生物传感器等 5 生物传感器的特点5 生物传感器的特点 1 生物传感器是由选择性好的主体材料构成的分 子识别元件 因此 一般不需进行样品的预处理 它 利用优异的选择性把样品中被测组分的分离和检测统 一为一体 测定时一般不需另加其它试剂 2 由于它的体积小 可以实现连续在位监测 3 响应快 样品用量少 且由于敏感材料是固定化 的 可以反复多次使用 4 传感器连同测定仪的成本远低于大型的分析仪器 因而便于推广普及 1 生物传感器是由选择性好的主体材料构成的分 子识别元件 因此 一般不需进行样品的预处理 它 利用优异的选择性把样品中被测组分的分离和检测统 一为一体 测定时一般不需另加其它试剂 2 由于它的体积小 可以实现连续在位监测 3 响应快 样品用量少 且由于敏感材料是固定化 的 可以反复多次使用 4 传感器连同测定仪的成本远低于大型的分析仪器 因而便于推广普及 二二 生物传感器的信号转换生物传感器的信号转换 生物传感器中的信号转换器是将分子识别元件 进行识别时所产生的化学的或物理的变化转换成可 生物传感器中的信号转换器是将分子识别元件 进行识别时所产生的化学的或物理的变化转换成可 用信号用信号的装置 生物传感器的信号转换器已有许多 种 其中到目前为止用得最多的且比较成熟的是 的装置 生物传感器的信号转换器已有许多 种 其中到目前为止用得最多的且比较成熟的是电 化学电极 电 化学电极 用它组成的生物传感器称为电化学生物 传感器 电化学电极可用作生物传感器的信号转换器的 电化学电极 一般可以分为两种类型 用它组成的生物传感器称为电化学生物 传感器 电化学电极可用作生物传感器的信号转换器的 电化学电极 一般可以分为两种类型 电位型电极 和电流型电极 电位型电极 和电流型电极 三三 敏感器件 分子识别元件 敏感器件 分子识别元件 1 酶 酶 Enzyme 及酶电极 及酶电极 1 酶的催化特性酶的催化特性 酶是生物体内产生并具有催化活性的一类蛋白质 酶是生物体内产生并具有催化活性的一类蛋白质 此类蛋白质表现出特异的催化功能 因此 酶被称为 生物催化剂 酶在生命活动中起着极为重要的作用 它们参加新陈代一谢过程中的所有生化反应 并以极 高的速度和明显的方向性维持生命的代谢活动 包括 生长 发育 繁殖与运动 可以说 没有酶生命将不 复存在 目前已鉴定出的酶有 此类蛋白质表现出特异的催化功能 因此 酶被称为 生物催化剂 酶在生命活动中起着极为重要的作用 它们参加新陈代一谢过程中的所有生化反应 并以极 高的速度和明显的方向性维持生命的代谢活动 包括 生长 发育 繁殖与运动 可以说 没有酶生命将不 复存在 目前已鉴定出的酶有2000余种 其中一半左 右已达均一纯度 余种 其中一半左 右已达均一纯度 100余种已能制得晶体 酶与一般催化剂相同 在相对浓度较低时 仅能 影响化学反应的速度 而不改变反应的平衡点 反应 前后其组成与质量均不发生明显改变 余种已能制得晶体 酶与一般催化剂相同 在相对浓度较低时 仅能 影响化学反应的速度 而不改变反应的平衡点 反应 前后其组成与质量均不发生明显改变 酶与一般催化剂的不同点如下 酶与一般催化剂的不同点如下 1 酶的催化效率比一般的催化剂高酶的催化效率比一般的催化剂高106 1013倍 倍 2 酶催化反应条件较为温和 在常温常压近中性条 件下即可进行 酶催化反应条件较为温和 在常温常压近中性条 件下即可进行 3 酶的催化具有高度的专一性酶的催化具有高度的专一性 2 电化学免疫传感器电化学免疫传感器 Immunosensor 3 组织传感器组织传感器 以动植物组织薄片材料作为生物敏感膜的电化 学传感器称为组织电极 此系酶电极的衍生型 电极 动植物组织中的酶是反应的催化剂 与 酶电极比较 组织电极具有如下优点 以动植物组织薄片材料作为生物敏感膜的电化 学传感器称为组织电极 此系酶电极的衍生型 电极 动植物组织中的酶是反应的催化剂 与 酶电极比较 组织电极具有如下优点 1 酶活性较离析酶高 酶活性较离析酶高 2 酶的稳定性增大 酶的稳定性增大 3 材料易于获得 材料易于获得 4 电化学电化学DNA 基因基因 传感器传感器 第八章 放射免疫技术第八章 放射免疫技术 第一节 放射免疫技术第一节 放射免疫技术 一 原理及分类一 原理及分类 二 常用的放射性核素 三 标记物制备及鉴定 四 抗血清鉴定 二 常用的放射性核素 三 标记物制备及鉴定 四 抗血清鉴定 第二节 放射免疫分析第二节 放射免疫分析 一 基本原理一 基本原理 二 实验方法及测定 第三节 免疫放射分析 二 实验方法及测定 第三节 免疫放射分析 一 基本原理一 基本原理 二 IRMA与RIA的比较二 IRMA与RIA的比较 免疫技术 免疫技术 以抗原 抗体反应原理为基 础 对样品中相应抗原或抗体进行检测 以抗原 抗体反应原理为基 础 对样品中相应抗原或抗体进行检测 标记技术 标记技术 将可被探测的示踪物质用化 学方法与化合物连接 将可被探测的示踪物质用化 学方法与化合物连接 标记免疫分析 标记免疫分析 用可微量或超微量检 测的示踪剂标记抗原 抗体 检测免疫反应 结果并确定待检物 用可微量或超微量检 测的示踪剂标记抗原 抗体 检测免疫反应 结果并确定待检物 标记免疫技术 基本概念标记免疫技术 基本概念 常见标记免疫技术常见标记免疫技术 放射免疫技术放射免疫技术 荧光免疫技术荧光免疫技术 酶免疫技术酶免疫技术 第一节 放射免疫技术 早期的放射免疫技术是基于早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应竞争性结合反应原 理的放射免疫分析 RIA 原 理的放射免疫分析 RIA 稍后又发展了 稍后又发展了非竞争 性结合 非竞争 性结合的免疫放射分析 IRMA 的免疫放射分析 IRMA 该类技术具有 灵敏度高 特异性强 重复性好 样品及试剂 用量少 操作简便且易于标准化等优点 广泛 应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微 量蛋白质 激素 小分子药物和肿瘤标志物的 定量分析 对相关学科的发展起到了极大地推 动作用 该类技术具有 灵敏度高 特异性强 重复性好 样品及试剂 用量少 操作简便且易于标准化等优点 广泛 应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微 量蛋白质 激素 小分子药物和肿瘤标志物的 定量分析 对相关学科的发展起到了极大地推 动作用 放射免疫放射免疫 RIARIA 以标记抗原与反 应系统中未标记 抗原竞争结合特 异性抗体来测定 待检样品中抗原 量 以标记抗原与反 应系统中未标记 抗原竞争结合特 异性抗体来测定 待检样品中抗原 量 免疫放射免疫放射 IRMAIRMA 以过量标记抗体 与抗原非竞争结 合 采用固相免 疫吸附载体分离 游离和结合标记 抗体 以过量标记抗体 与抗原非竞争结 合 采用固相免 疫吸附载体分离 游离和结合标记 抗体 放射受体分析 RRA 放射受体分析 RRA 放射配体结合 分析RBA 放射配体结合 分析RBA 其它其它 一 放射免疫技术 原理及分类一 放射免疫技术 原理及分类 二 放射免疫技术 常用的放射性 核素 二 放射免疫技术 常用的放射性 核素 125125I I 3 3H 射线 理化性 活泼 差 核素丰度 90 半衰期 60 2d 12 3y 标记方法 简单 复杂 标记设备 低廉 昂贵 测量条件 简单 复杂 H 射线 理化性 活泼 差 核素丰度 90 半衰期 60 2d 12 3y 标记方法 简单 复杂 标记设备 低廉 昂贵 测量条件 简单 复杂 常用标记核素 125碘 标记物的制备 标记125碘 标记物的制备 标记 125125I I 化学或酶促反应 将 放射性负电碘离子氧 化成碘原子或正电碘 离子 通过取代反应 置换被标记物分子中 酪氨酸或酪胺残基以 及组胺残基上的氢原 子 化学或酶促反应 将 放射性负电碘离子氧 化成碘原子或正电碘 离子 通过取代反应 置换被标记物分子中 酪氨酸或酪胺残基以 及组胺残基上的氢原 子 125125I或 I或 125125I I 125125I 标记物 I 标记物 混合物 混合物 Ch T LPO氧化 Ch T LPO氧化 取代反应取代反应 直接标记法直接标记法 三 放射免疫技术 标记物制备及鉴定 使用无还原剂的 高比放射性碘源 使用无还原剂的 高比放射性碘源 被标记物用量要 少 被标记物用量要 少 ch T用量要低ch T用量要低 控制总反应体积 200 l 控制总反应体积 200 l 反应时间1 2分钟反应时间1 2分钟 弱碱性反应条件弱碱性反应条件 间接标记法间接标记法 联接标记 联接标记 bolton Hunter 预先将 预先将125 125I用 I用 ch T法标记琥珀酰胺 酯 制成的 法标记琥珀酰胺 酯 制成的125 125I 化脂功 能基团可与蛋白分子上 的氨基酸残基反应 从 而使待标记物被碘化 I 化脂功 能基团可与蛋白分子上 的氨基酸残基反应 从 而使待标记物被碘化 bolton Hunter 125碘 标记物的制备 纯化125碘 标记物的制备 纯化 凝胶过滤 法 凝胶过滤 法 离子交换 层 析法 离子交换 层 析法 聚丙烯酰 胺 凝胶电泳 聚丙烯酰 胺 凝胶电泳 高效液相 色 谱法 高效液相 色 谱法 聚合 损伤物 标记蛋白 游离 聚合 损伤物 标记蛋白 游离125 125I I 125碘 标记物的制备 鉴定125碘 标记物的制备 鉴定 标记物标记物 高比放射性高比放射性 高纯度高纯度 完整免疫活 性 完整免疫活 性 放射化学纯度放射化学纯度 单位标记物中结合于被标 记物上的放射性占总放射性 的百分率 单位标记物中结合于被标 记物上的放射性占总放射性 的百分率 应大于95 应大于95 免疫活性免疫活性 标记物与抗体结合的能力标记物与抗体结合的能力 标记物与过量抗体反应百分 比 标记物与过量抗体反应百分 比 该值越大 标记物免疫活性 好 该值越大 标记物免疫活性 好 比放射比放射 单位化学量标记物 中所含的放射性强度 单位化学量标记物 中所含的放射性强度 单位 Ci g mCi mg Ci mmol 单位 Ci g mCi mg Ci mmol 比放射性过高 将 影响标记物免疫活性 比放射性过高 将 影响标记物免疫活性 计算法 计算法 依据标记反应 中放射性核素的利用率 标记率 来计算标记物 的比放射性 依据标记反应 中放射性核素的利用率 标记率 来计算标记物 的比放射性 自身置换法 自身置换法 比较标记 抗 原与标准抗原的免疫活性 来 测定标记物的比放射性 比较标记 抗 原与标准抗原的免疫活性 来 测定标记物的比放射性 结果准 测定复杂结果准 测定复杂 比放射性 计算法比放射性 计算法 结果欠准 计算简便结果欠准 计算简便 四 放射免疫技术 抗血清鉴定 抗体分子上一个抗原结合 部 位与相应的抗原决定簇之间 的 结合强度 抗体分子上一个抗原结合 部 位与相应的抗原决定簇之间 的 结合强度 用亲和常数Ka表示 用亲和常数Ka表示 单位为稀度单位 LM单位为稀度单位 LM 1 1 Ka值高 10Ka值高 109 12 9 12L mol 有 助于提高灵敏度 精确度和 准确度 L mol 有 助于提高灵敏度 精确度和 准确度 亲和性亲和性 亲合力高亲合力高 亲合力低亲合力低 第二节 放射免疫分析 一 放射免疫分析 基本原理 竞争性结合反应的经 典标记抗原 Ag 和 非标记抗原 Ag 与限 量抗体 Ab 竞争性结合 竞争性结合反应的经 典标记抗原 Ag 和 非标记抗原 Ag 与限 量抗体 Ab 竞争性结合 Ag 和Ag具有等同的 与Ab结合能力 Ag 和Ag具有等同的 与Ab结合能力 Ab限量 Ag 定量 Ag 和Ag的量大于 Ab结合位点 二者 通过竞争方式与Ab 结合 随着Ag增加 Ag 与Ab结合形成 Ag Ab复合物的放 射量降低 二者变化 成函数关系 Ab限量 Ag 定量 Ag 和Ag的量大于 Ab结合位点 二者 通过竞争方式与Ab 结合 随着Ag增加 Ag 与Ab结合形成 Ag Ab复合物的放 射量降低 二者变化 成函数关系 以未结合的Ag 为 F Ag Ab复合物 为B 则B F或 B B F 与Ag的 量变存在着函数 关系 剂量反应 曲线 以未结合的Ag 为 F Ag Ab复合物 为B 则B F或 B B F 与Ag的 量变存在着函数 关系 剂量反应 曲线 注 注 T即是即是B与与F的总和的总和 二 放射免疫分析 实验方法及测定 抗原抗体反应抗原抗体反应 Ag Ag AgAg 反应条件 体积 温度 时间 pH 反应条件 体积 温度 时间 pH AbAb 标准Ag 样品Ag 标准Ag 样品Ag 平衡 非平衡 一步法 二步法 平衡 非平衡 一步法 二步法 第三节 免疫放射分析 一 免疫放射分析 基本原理 以过量以过量125 125I标记抗体与待测抗原进行非竞争 性免疫结合反应 用固相免疫吸附剂对B或F 进行分离 其灵敏度和可测范围均优于RIA 操作也较RIA简单 I标记抗体与待测抗原进行非竞争 性免疫结合反应 用固相免疫吸附剂对B或F 进行分离 其灵敏度和可测范围均优于RIA 操作也较RIA简单 单位点 IRMA单位点 IRMA 先用先用先用先用过量标记抗体过量标记抗体过量标记抗体过量标记抗体与与与与 待测抗原进行反应 形成待测抗原进行反应 形成待测抗原进行反应 形成待测抗原进行反应 形成 抗原抗体复合物 用抗原抗体复合物 用抗原抗体复合物 用抗原抗体复合物 用固相固相固相固相 抗原抗原抗原抗原结合未结合标记抗体结合未结合标记抗体结合未结合标记抗体结合未结合标记抗体 并将其分离并将其分离并将其分离并将其分离 测定测定测定测定上清液上清液上清液上清液 的放射量的放射量的放射量的放射量 双位点 IRMA双位点 IRMA 先用先用固相抗体固相抗体固相抗体固相抗体与抗原结 合 再用 与抗原结 合 再用过量的标记过量的标记过量的标记过量的标记 抗体抗体抗体抗体与抗原的另一决定 簇结合 形成 与抗原的另一决定 簇结合 形成固相抗体固相抗体固相抗体固相抗体 抗原抗原抗原抗原 标记抗体标记抗体标记抗体标记抗体复合物 洗弃剩余标记抗体 测固相 上放射性 复合物 洗弃剩余标记抗体 测固相 上放射性 二 IRMA与RIA比较二 IRMA与RIA比较 RIA IRMA 标记物 抗原 抗体 标记物 抗原 抗体 原理 竞争性结合 非竞争结合 反应体系 Ag Ag Ab 原理 竞争性结合 非竞争结合 反应体系 Ag Ag Ab 固相固相Ab Ab Ag 反应动力学 慢 快 灵敏度 相对低 高 检测范围 窄 宽 1 2 数量级 特异性 差 PcAb 优 McAb 标准曲线 Ab Ab Ag 反应动力学 慢 快 灵敏度 相对低 高 检测范围 窄 宽 1 2 数量级 特异性 差 PcAb 优 McAb 标准曲线 结合率与测值成结合率与测值成反反比 结合率与测值成比 结合率与测值成正正比比 待测抗原 大小分子 待测抗原 大小分子 二抗原决定簇 二抗原决定簇 放射免疫分析技术的灵敏度高 特异性 强 精密度好 常用于各种激素 微量 蛋白质 肿瘤标志物和药物等微量物质 的测定 但由于放射污染和危害 常用 核素半衰期短 试剂盒稳定期不长等诸 多不足 RIA将逐渐被取代 放射免疫分析技术的灵敏度高 特异性 强 精密度好 常用于各种激素 微量 蛋白质 肿瘤标志物和药物等微量物质 的测定 但由于放射污染和危害 常用 核素半衰期短 试剂盒稳定期不长等诸 多不足 RIA将逐渐被取代 放射免疫分析技术的应用放射免疫分析技术的应用 第九章 荧光免疫技术第九章 荧光免疫技术 荧光免疫技术是将抗原抗体反应的 特异性与荧光物质检测的敏感性和 直观性结合起来的一种免疫分析技 术 第一节 荧光标记物的制备 一 荧光和荧光物质一 荧光和荧光物质 二 荧光标记物的制备二 荧光标记物的制备 一一 荧光荧光 1 荧光的产生 一些化学物质能从外界吸收并 储存能量 如光能 化学能 而进入激发态 当 其从激发态再回复至基态时 过剩的能量以荧 光形式释放出来 光致荧光 化学荧光 X线荧光或阴极射线荧光 2 荧光效率 荧光效率是指荧光分子将吸 收的光能转变成荧光的百分率 荧光分子不 会将全部吸收的光能都转变成荧光 而是或 多或少地以其他形式释放 100 吸收光的光量子数 发射荧光的光量子数 荧光效率 3 荧光寿命 指荧光物质被一瞬时光脉冲激发 后产生的荧光随时间而衰减到一定程度时所用 的时间 4 荧光的淬灭 指荧光分子的辐射能力受到激 发光较长时间的照射后会减弱的现象 这是由 于激发态分子的电子不能回复到基态 所吸收 的能量无法以荧光形式发射所致 5 影响因素 1 pH 2 温度 3 荧光素的浓度 4 杂质对细胞荧光染色的影响 5 某些细胞固定剂对细胞荧光染色的影响 6 苯胺 酚 硝基苯及一些卤化物影响 二二 荧光物质荧光物质 1 常见荧光素 1 异硫氰酸荧光素 fluorescein isothiocyanate FITC 2 四乙基罗丹明 rhodamine RB200 3 四甲基异硫氰酸罗丹明 tetramethyl rhodamine isothiocynate TRITC 4 藻红蛋白 phycoerythrin PE 2 其他荧光物质 1 镧系稀土元素 2 酶作用后产生荧光的物质 第二节 荧光免疫显微技术第二节 荧光免疫显微技术 一 基本原理一 基本原理 荧光免疫显微技术是以荧光显微镜为检测工 具 用荧光素标记特异性抗体或抗抗体 检测 固定组织细胞上的抗原或血清中的抗体 常用 于定性和定位检查的一门技术 二 技术类型二 技术类型 根据标记物和反应程序的不同 可将荧光免疫 显微技术分为直接法 间接法 补体结合法和 双标记法等四类 1 直接法 直接法 用荧光素标记特异性抗体 将特异性荧光抗体 直接滴加于待测标本上 直接与相应抗原反应 图18 1 此法常用于细菌和病毒等病原微生物的快速检 测 肾活检及皮肤活检的免疫病理检查 2 间接法 间接法 用荧光素标记抗球蛋白抗体 抗抗体 待基质 标本中的抗原与相应抗体 第一抗体 反应 再 用荧光素标记的抗抗体 第二抗体 结合第一抗 体 通过荧光现象检查抗原或抗体 图18 2 此法常用于检测各种自身抗体 临床应用 荧光免疫显微技术在临床检验中已用作细菌 病毒和 寄生虫的检验及自身免疫病的诊断等 1 血清中自身抗体的检测 2 各种微生物的快速检查和鉴定 3 寄生虫感染的诊断 4 白细胞分化抗原的检测 5 人类白细胞抗原 HLA 肿瘤组织中肿瘤抗原 组 织中免疫球蛋白和补体组分 激素和酶的组织定位等 的检测 第三节 荧光免疫测定技术第三节 荧光免疫测定技术 1 非均相荧光免疫测定法 时间分辨荧光免疫测定 2 均相荧光免疫测定法 荧光偏振免疫测定底物标记荧光免疫测 定 一 时间分辨荧光免疫测定 基本原理 技术类型 技术要点 方法评价和临床应用 一一 基本原理 基本原理 时间分辨荧光免疫测定是用镧系稀土元素螯合物 如 Eu3 螯合物 标记抗体或抗原 检测标本中的相应抗 原或抗体 此螯合物具有较长荧光寿命 利用时间分 辨荧光分析仪延缓测量时间 可排除标本中非特异性 荧光的干扰 所得信号完全是稀土元素螯合物发射的 特异荧光 另一个特点是激发光与荧光的波长差别显 著 其波长转变达270nm 可有效排除激发光的干 扰 测得的荧光为稀土元素螯合物发出的特异性荧光 信号 图18 4 二二 技术类型 技术类型 1 固相双位点夹心法 2 固相抗原竞争法 3 固相抗体竞争法 1 固相双位点夹心法 固相双位点夹心法 使用针对抗原不同决定簇的两种特异性抗体 一种包被在固相上 另一种用Eu3 标记 标准 品或待测抗原先与固相抗体反应 洗涤后再加 入Eu3 标记的抗体 再次温育 形成固相抗体 抗原 Eu3 标记抗体复合物 充分洗涤后加入 增强液 测定荧光强度 所测得的荧光强度与 待测抗原浓度成正比 图18 5 2 固相抗原竞争法 固相抗原竞争法 将大分子抗原直接 或小分子半抗原通过化学 偶联法制成半抗原 蛋白质结合物 包被在固 相上 成为固相抗原 待测抗原和固相抗原竞 争结合定量的Eu3 标记抗体 标本中待测抗原 浓度越高 则Eu3 标记抗体结合到固相上的量 越少 因此所测得的荧光强度与标本中待测抗 原浓度成反比 3 固相抗体竞争法 固相抗体竞争法 待测标本中抗原和Eu3 标记的抗原与固相抗体 特异性抗体包被固相 发生竞争结合 温育洗涤 后在固相中加入荧光增强液 测定荧光强度 所 测得的荧光强度与待测抗原含量成反比 目前 为了生产试剂盒的方便 常用抗抗体 Ab2 包被 固相 这种固相抗抗体实际上是一种通用的分 离剂 分离Eu3 标记抗原和Eu3 标记抗原抗体 复合物 第九章 酶免疫技术 第一节 酶免疫技术的特点 一 酶和酶作用底物 二 酶标记抗体或抗原 三 固相载体 第一节 酶免疫技术的特点 一 酶和酶作用底物 二 酶标记抗体或抗原 三 固相载体 第二节酶免疫技术的分类 一 均相酶免疫测定 二 非均相酶免疫测定 第三节 酶联免疫吸附试验 一 基本原理 二 方法类型及反应原理 第二节酶免疫技术的分类 一 均相酶免疫测定 二 非均相酶免疫测定 第三节 酶联免疫吸附试验 一 基本原理 二 方法类型及反应原理 放射免疫技术放射免疫技术 发光免疫技术发光免疫技术 酶免疫技术酶免疫技术 三大经典标记技术三大经典标记技术三大经典标记技术 第一节 酶免疫技术的特点 主要试剂 主要试剂 酶标记的抗体或抗原酶标记的抗体或抗原 酶标物特点 酶标物特点 免疫学活性 酶对底物的催化活性 免疫学活性 酶对底物的催化活性 抗原抗体反应的特异性抗原抗体反应的特异性 酶高效催化反应的专一性酶高效催化反应的专一性 原理及特点原理及特点 特点 特点 灵敏度高 特异性强 准确性好 灵敏度高 特异性强 准确性好 酶标记试剂能够较长时 间保持稳定 酶标记试剂能够较长时 间保持稳定 操作简便 对环境没有 污染 操作简便 对环境没有 污染 易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广的 新方法 易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广的 新方法 原理 原理 酶标抗体 抗原 与抗原 抗体 的特异性反应 酶标抗体 抗原 与抗原 抗体 的特异性反应 酶对底物的显色反应酶对底物的显色反应 对抗原或抗体进行定位 定性或定量的测定分析 对抗原或抗体进行定位 定性或定量的测定分析 原理及特点原理及特点 辣根过氧化物酶 HRP 辣根过氧化物酶 HRP 糖蛋白 主酶 亚铁血红素 辅基 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心 糖蛋白 主酶 亚铁血红素 辅基 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心 RZ值 403nm 辅基 与275nm 主酶 OD值之比 RZ值 403nm 辅基 与275nm 主酶 OD值之比 RZ值与酶活性无 关 酶活性单位比 RZ值更为重要 RZ值与酶活性无 关 酶活性单位比 RZ值更为重要 ELISA中应用最为广 泛的标记用酶 ELISA中应用最为广 泛的标记用酶 常用酶常用酶 酶和酶作用底物酶和酶作用底物 碱性磷酸酶 AP 碱性磷酸酶 AP 菌源性AP 肠粘膜AP 菌源性AP 肠粘膜AP 半乳糖苷酶 Gal 半乳糖苷酶 Gal 用于均相酶 免疫测定 用于均相酶 免疫测定 常用酶常用酶 酶和酶作用底物酶和酶作用底物 AP的 底物 AP的 底物 Gal 的底物 Gal 的底物 对 硝基苯磷酸酯 pNPP 对 硝基苯磷酸酯 pNPP 4 甲基伞酮基 D 半 乳糖苷 4MUG 4 甲基伞酮基 D 半 乳糖苷 4MUG 经AP作用后的产物为黄色对 硝基酚 最大吸收峰波长为 405 nm 经AP作用后的产物为黄色对 硝基酚 最大吸收峰波长为 405 nm 酶作用后 生成高强度 荧光物 用荧光计 测 量 酶作用后 生成高强度 荧光物 用荧光计 测 量 常用底物常用底物 酶和酶作用底物酶和酶作用底物 酶免疫技术的核心组成部分酶免疫技术的核心组成部分 酶结合物 conjugate 酶标记物 酶结合物 conjugate 酶标记物 通过化学反应或免 疫学反应 让酶与 抗体或抗原形成的 结合物 通过化学反应或免 疫学反应 让酶与 抗体或抗原形成的 结合物 二 酶标记抗体或抗原二 酶标记抗体或抗原 固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将 游离和结合的酶标记物迅速分离的最常 用方法 固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将 游离和结合的酶标记物迅速分离的最常 用方法 固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合 到固相载体的表面 固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合 到固相载体的表面 三 固相载体三 固相载体 要求要求 结合抗体或抗原的容量大结合抗体或抗原的容量大 抗体或抗原牢固地固定在其表面抗体或抗原牢固地固定在其表面 不影响免疫反应性不影响免疫反应性 利于反应充分进行利于反应充分进行 固相方法简便易行 快速经济固相方法简便易行 快速经济 种类种类 塑料制品塑料制品 微颗粒微颗粒 膜载体膜载体 固相载体固相载体 将抗原或抗体结合于固相载体将抗原或抗体结合于固相载体 用1 5 的牛血清白蛋白或5 20 小牛血清 消除固相载体表面未结合的位点 消除非特 异性吸附 用1 5 的牛血清白蛋白或5 20 小牛血清 消除固相载体表面未结合的位点 消除非特 异性吸附 包被 coating 包被 coating 封闭 blocking 封闭 blocking 包被与封闭包被与封闭 第二节 酶免疫技术分类 酶 免 疫 技 术 酶 免 疫 技 术 酶免疫组化酶免疫组化 酶免疫测定酶免疫测定 均 相均 相 非均相非均相 固相酶免疫测定固相酶免疫测定 液相酶免疫测定液相酶免疫测定 组织切片或其它标本中抗原的定位组织切片或其它标本中抗原的定位 液体标本中抗原或 抗体的定性和定量 液体标本中抗原或 抗体的定性和定量 用于小分子激素和半抗原 如药物 的测定用于小分子激素和半抗原 如药物 的测定 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后 标 记酶的活性会发生改变 不用分离结合和 游离酶标记物 通过测定标记酶的活性的 改变 而确定抗原或抗体的含量 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后 标 记酶的活性会发生改变 不用分离结合和 游离酶标记物 通过测定标记酶的活性的 改变 而确定抗原或抗体的含量 原理原理 一 均相酶免疫测定一 均相酶免疫测定 最具代表性的两种技术最具代表性的两种技术 酶放大免疫测定技术EMIT酶放大免疫测定技术EMIT enzyme mutiplied immunoassay technique 克隆酶供体免疫分析 CEDIA克隆酶供体免疫分析 CEDIA cloned enzyme donor immunoassay 均相酶免疫测定均相酶免疫测定 利用利用DNA重组技术制备 重组技术制备 半乳糖苷酶的两个片段 大片段为酶受体 半乳糖苷酶的两个片段 大片段为酶受体 enzyme acceptor EA 小片段为酶供体 小片段为酶供体 enzyme donor ED 单独的两个片段均无 活性 在一定条件下结合后可显示酶的活性 单独的两个片段均无 活性 在一定条件下结合后可显示酶的活性 EMIT示意图 如将毒品如将毒品 如吗啡及其衍生物如吗啡及其衍生物 与溶菌酶结合成酶标记物 测定时将待测样品 酶标记物与抗体 一起混合 让前二者与其相应抗体竞争结合后 加酶底物 与溶菌酶结合成酶标记物 测定时将待测样品 酶标记物与抗体 一起混合 让前二者与其相应抗体竞争结合后 加酶底物 藤黄微球菌藤黄微球菌 测定反应体系酶的活 性 若酶标抗原与抗体结合后 抗体与标记的酶紧密接触 使酶的活性中心受到影响 而其酶 活性受抑制 测定反应体系酶的活 性 若酶标抗原与抗体结合后 抗体与标记的酶紧密接触 使酶的活性中心受到影响 而其酶 活性受抑制 图图A 若待测样品中抗原与抗体结合 酶的活性得以发挥 若待测样品中抗原与抗体结合 酶的活性得以发挥 图图B 酶的活性与待测 样品中抗原的量成正比 测定酶活性以标准曲线推算出待测抗原的量 酶的活性与待测 样品中抗原的量成正比 测定酶活性以标准曲线推算出待测抗原的量 CEDIA示意图 一类是抗体能增强酶的活性 将甲状腺素一类是抗体能增强酶的活性 将甲状腺素 T 与苹果酸脱氢酶与苹果酸脱氢酶 MDH 共价结合成酶标记 物后 共价结合成酶标记 物后 MDH活性被抑制 当标记抗原与特异性抗体结合时 被抑制的酶的活性可逆性 地恢复 活性被抑制 当标记抗原与特异性抗体结合时 被抑制的酶的活性可逆性 地恢复 分类 分类 液相酶免疫测定 固相酶免疫测定 以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验 ELISA 是目前最为常用的固相酶免疫测定 液相酶免疫测定 固相酶免疫测定 以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验 ELISA 是目前最为常用的固相酶免疫测定 与均相不同 之处 与均相不同 之处 需分离游离与结合的酶标记物需分离游离与结合的酶标记物 二 非均相酶免疫测定二 非均相酶免疫测定 第三节 酶联免疫吸附试验 底物显色底物显色 定性或定量的分析定性或定量的分析 原理原理 包被包被 反应反应 加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体 加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体 洗涤洗涤 使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离 使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离 1 2 34 一 基本原理一 基本原理 固相的抗原或抗体固相的抗原或抗体 酶标记物 酶结合物酶标记物 酶结合物 酶反应的底物酶反应的底物 三个必要试剂三个必要试剂 二 方法类型及反应原理二 方法类型及反应原理 双抗体夹心法双抗体夹心法 方法 方法 用已知抗体包被 加入待检血清 再加酶 标抗体 加底物显色 用已知抗体包被 加入待检血清 再加酶 标抗体 加底物显色 应用 应用 二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原 甲胎蛋白 HCG等 二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原 甲胎蛋白 HCG等 ELISA检测抗原的方法ELISA检测抗原的方法 双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原 E E E E E E E EE E E E E EE EE E 竞争法 方法 用已知抗体包被 加入待测血清 再加酶标抗原 酶标抗 原与待检物竞争与包被物结合 加底物显色 应用 用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原 药物 激素等 ELISA检测抗原的方法ELISA检测抗原的方法 竞争法测抗原竞争法测抗原 E E E E E E E E E EE EE E 2 加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合 3 加酶作用 的底物不显色 或显色弱 3 加酶作用 的底物显色 1 已知抗体包 被于载体表面 1 已知抗体包 被于载体表面 2 加酶标抗原 酶标抗原与抗 体结合 2 加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合 3 加酶作用 的底物不显色 或显色弱 3 加酶作用 的底物显色 1 已知抗体包 被于载体表面 1 已知抗体包 被于载体表面 2 加酶标抗原 酶标抗原与抗 体结合 E E 间接法间接法 方法方法 用已知抗原包被 加入待测血清 再加酶标的抗人IgG 抗 抗体或二抗 加底物显色 用已知抗原包被 加入待测血清 再加酶标的抗人IgG 抗 抗体或二抗 加底物显色 优点优点 一种酶标抗体检测各种与抗原相应的抗体一种酶标抗体检测各种与抗原相应的抗体 应用应用 常用于HCV抗体 HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定常用于HCV抗体 HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定 ELISA检测抗体的方法ELISA检测抗体的方法 间接法测抗体间接法测抗体 E E E E E E E EE E E EE E E EE E 双抗原夹心法双抗原夹心法 原理 原理 类似双抗体夹心法类似双抗体夹心法 操作步骤操作步骤 类似类似 应用 应用 乙型肝炎表面抗体乙型肝炎表面抗体 ELISA检测抗体的方法ELISA检测抗体的方法 竞争法竞争法 原理 原理 类似检测抗原的竞争法类似检测抗原的竞争法 应用应用 乙型肝炎病毒核心抗体 HBcAb 和乙 型肝炎病毒e抗体 HBeAb 的检测 乙型肝炎病毒核心抗体 HBcAb 和乙 型肝炎病毒e抗体 HBeAb 的检测 ELISA检测抗体的方法ELISA检测抗体的方法 捕获法捕获法 应用 应用 病原体急性感染诊断中的IgM型抗体 甲型肝炎HAV IgM抗体 乙型肝炎病毒核心HBc IgM抗体 病原体急性感染诊断中的IgM型抗体 甲型肝炎HAV IgM抗体 乙型肝炎病毒核心HBc IgM抗体 ELISA检测抗体的方法ELISA检测抗体的方法 捕获法 原理 原理 抗人IgM 链抗体包被 捕获待测标本中IgM类抗体 加入特异性抗原和酶标记特 异性抗原的抗体 底物显色 抗人IgM 链抗体包被 捕获待测标本中IgM类抗体 加入特异性抗原和酶标记特 异性抗原的抗体 底物显色 捕获法原理捕获法原理 E EE E E EE EE E 1 固相化抗人 IgM 1 固相化抗人 IgM 1 固相化抗人 IgM 2 加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合 3 加特异性 抗原 与特异 性抗体结合 4 加酶标抗体 与特异性抗原结 合 加底物显色 2 加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合 3 加特异性抗 原 不能与非 特异性IgM结合 4 加酶标抗体 无抗原结合 加底物不显色 1 固相化抗人 IgM 2 加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合 3 加特异性 抗原 与特异 性抗体结合 4 加酶标抗体 与特异性抗原结 合 加底物显色 2 加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合 3 加特异性抗 原 不能与非 特异性IgM结合 4 加酶标抗体 无抗原结合 加底物不显色 第十一章 蛋白质组学研究第十一章 蛋白质组学研究 蛋白质组学蛋白质组学 最新进展最新进展 蛋白质组学蛋白质组学 The identification characterization and quantification of all proteins involved in a particular pathway organelle cell tissue organ or organism that can be studied in concert to provide accurate and comprehensive data about that system 对特定的通路 细胞器 细胞 组织 器官和肌体中 包含的所有蛋白质进行鉴定