高效人工合成胰岛素工艺可行性研究.doc

高效人工合成胰岛素工艺可行性研究 作者：生物工程二班 罗文杰转贴自：本站原创点击数：2378更新时间：2004-6-29文章录入：admin 一、项目背景据WHO统计，全世界糖尿病患者已接近1.2亿，而我国目前糖尿病患者的总数已达到3000万人，跃居世界第二位，其中数百万患者长期使用胰岛素治疗。糖尿病例已成为仅次于心脑血管病症和癌症的第三大死亡疾病与顽症。随着我国经济的发展，国人的生活水平的提高，糖尿病的发生率将更高，糖尿病患者的数量也将增加，糖尿病将成为影响我国国民健康水平的重大疾病。国内外对糖尿病越来越重视，各方面研究也在不断的进行之中，并不断有相应的研究成果产生。以知是糖尿病是产生机理是：当人体胰腺b 细胞被破坏时，细胞产生胰岛素的能力丧失，这样将导致1 型糖尿病的发生；此外，当患者餐时胰岛素分泌量不足，因而无法克服餐后血糖的升高时，2型糖尿病就会发生。因此，不管是1型还是2型糖尿病，都存在有胰岛素分泌的不足，只不过1型糖尿病患者胰岛素分泌能力完全丧失。由此可见，1型糖尿病患者或者一部分 2型糖尿病患者需要接受胰岛素治疗，以补充自身胰岛素的不足或者缺失。目前国内市场上传统的降糖药物疗法并不能使糖尿病行到根本性治疗，而胰岛素则是通过调节葡萄糖的产生和分解来控制葡萄糖在人体中的供求平衡。其可视为是目前治疗糖尿病的最佳方式。同样由于胰岛素半衰期短，糖尿病患者随时需要注射胰岛素，一般来说一个糖尿病患者每天需要注射1克胰岛素。目前医用的胰岛素主要有两种，一种是从动物脏器中生化提取的动物胰岛素，如猪胰岛素、牛胰岛素等，动物脏器中生化提取产量低、成本高（100公斤动物胰腺只能提取4-5克胰岛素，一个病人所需胰岛素要从40头牛或50头猪的胰腺中提取）、纯度低，疗效差；一种是通过基因工程手段的人胰岛素，基因重组人胰岛素纯度高、疗效好。目前国内临床逐渐由国产的猪胰岛素（26.9元/400单位）转向基因工程人胰岛素。作为人体中惟一降低血糖的激素，人胰岛素的市场稳定性高，且呈不断增长态势。1982年投放市场后的两年，销售额分别增长30%和50%；1996年发达国家几乎都用人胰岛素，销售额为8.84亿美元；1998年人胰岛素的全求销售额达到25亿美元（预计2000年销售额不低于19.5亿美元），位于所有药物的前100名，位于生物工程药物的前几名。目前人胰岛素主要应用于西方发达国家，如美国和西欧等国。但随着我国经济的不断发展，人民生活水平的不断提高，人胰岛素在我国国内的应用也必将大量增加。国内外市场对人胰岛素的需求将始终处于增长的状态之中，市场将不断增大。二、国内外生产水平 现在有三个国家在生产人胰岛素，为丹麦、美国和我国。主要公司有美国Eli lilly公司、丹麦Nove和我国的通化东宝集团。1997年1月经我国卫生部批准，美国Eli lilly公司的基因重组短效人胰岛素进入我国临床使用，丹麦Nove在中国的合资药厂（分装）所生产“诺和灵”胰岛素也逐渐占领国内市场。目前国内临床逐渐由国产的猪胰岛素（26.9元/400单位）转向基因工程人胰岛素，人胰岛素在中国每年有几个亿的潜在市场陈。1998年10月，中国第一支基因重组人胰岛素，由通化东宝与美国泰康合资兴建的安泰克（Gan Tech）生物工程有限公司研制成功，并于1999年1月正式投放市场。全球最大的胰岛素生产企业，世界糖尿病领域的先导-丹麦诺和诺德公司生产的在中国上市的唯一的、剂型齐全的人胰岛素系列产品诺和灵人胰岛素产品系列为例：短效中性可溶性人胰岛素，采用国际推荐的黄色色标，用英文字母 R来表示，又称它为诺和灵 R，具有瓶装和笔芯两种剂型。短效诺和灵人胰岛素起效快，可在餐前30分钟内注射，主要用于降低餐后的高血糖；作用维持时间短，因此需要一天内多次注射，一般每天2-3次。中效人胰岛素，采用国际推荐的绿色色标，用英文字母N 表示，又称为诺和灵N， 具有瓶装和笔芯两种剂型。中效诺和灵笔芯人胰岛素起效较慢，作用维持时间可以达到24小时，主要作用是维持人体胰岛素的基础分泌，每天单独注射1-2次或与短效胰岛素诺和灵R混合使用。其价格为： 诺和灵30R 40iu/ml10ml 63.6 73.1 盒 诺和诺德（天津） 针剂 诺和灵30R预混 40iu10 63.6 73.1 支 天津市生物化学制药厂 针剂 目前国内的人胰岛素市场原料的竞争不是十分激烈，主要在几个大的医药集团之间。而其需求十分旺盛，药品利润也较高。三、生产工艺本工艺的原理就是研发新的高产人胰岛素的大肠杆菌菌种，增加发酵能力，在不改变生产工艺和流程情况下提高人胰岛素的产量。最近日本千叶大学清野进教授领导的科研小组发现了一种与胰岛素分泌有密切关系的蛋白质，清野进发现的这种蛋白质存在于分泌胰岛素的细胞里，起感知器的作用，能够检测信息传递物质“环腺苷磷酸”。动物实验表明，在这种蛋白质不起作用的时候，胰岛素的分泌量就大大减少。目前各种人胰岛素生产菌中都缺少该蛋白质，则其生产能力也必将受到影响。本次工艺原理就是测得该蛋白质的表达基因，用人工合成法合成该蛋白质基因，之后选择大肠杆菌的质粒作为运载体来运载胰岛素基因，可以使用pUC18质粒载体。选择限制性内切酶去切割人工合成的人胰岛素基因和质粒，使它们有同一个切点，这样就可以把人工合成的人胰岛素基因接到环状质粒的运载体上，组成重组体，把新组成的重组体再引入以有人胰岛素基因的大肠杆菌。在pUC18载体中，有两个标记基因，一是Apr基因，它专门用于指示DNA分子是否进入了宿主细胞，另一个是LacZa 基因，它能产生-半乳糖苷酶-链，当该基因转入适当的大肠杆菌宿主细胞后，转化细胞可在加有诱导物：异丙基-D-硫代半乳糖苷（简称IPTG）和检测试剂（X-Gal试剂）的培养基上形成兰色菌落。当把重组DNA分子导入适当的大肠杆菌细胞中时，在加有氨苄青霉素、IPTG和X-Gal的平板就可观察到白色菌落。在同一平板上出现的兰色菌落就是没有外源DNA插入的原载体。将有重组DNA分子的大肠杆菌细胞分离培养，选育出可以所需的蛋白质而提高人胰岛素的产量的菌种。在经过几代的遗传性状的观察后，稳定的高产的菌种即可投入生产中。待大肠杆菌生长经过几何增长区后既可进行人胰岛素的提取了，可以使用我国目前常用的减压浓缩法。其主要步骤是：1）提取粗制品：将大肠杆菌破壁后，加入1520倍量的酸性酒精溶液，使PH为2530，醇含量为70%左右，在温度为13150C搅拌提取3h,压滤，使浸液尽量滤出。残渣再用上法提取一次。合并二次浸出液，放碱化罐中，在10150C下加入氨水，使pH达828，4，拌搅35/min立即压滤，于澄清的滤液中迅速加入24 mol/L硫酸使pH调至2530。在0左右放置过夜使酸性杂蛋白沉降，分取清液，真空浓缩（300C以下），使浓缩液量到原体积1/71/9，将浓缩液在10min之内迅速加温至500G立即用冰冷却至00C，放置3h，将上层脂肪分离（回收胰岛素），澄清的浓缩液，调pH达25，在20250C下搅拌加入溶液容积25%的精盐，使全部溶解，置冷处放置34h沉淀，用绢布滤集沉淀，再用无水丙酮洗涤数次（除去剩余的脂肪和水），300C以下真空干燥得粗制品。2）精制：称取粗制品用pH22的710倍量的酸水溶解，加30%（按酸水容积）冷丙酮，用5mol/LNH40H调至pH 4.2，再补加所用氨水量的30%冷丙酮。在5以下放置过夜，抽滤，沉淀留用回收胰岛素。取滤液用5mol/LNH4OH调至pH 6264，加入20氯化锌（ZnC12），如pH变偏酸再调至pH 6.0，在冰箱中放置过夜，抽滤，滤液口收胰岛素。滤饼称重，每克干物约用50ml 20% 枸椽酸溶解。加入固体ZnC12 0O8g,加丙酮16 m1，搅拌均匀，补加水至100 m1，调pH 6062，放冰箱中48 h以上析出结晶，过滤，滤饼收取；滤出母液按上条件，在冰箱中放置23d,尚可收口部分结晶。取结晶，用丙酮洗2次，乙醚洗1次，置P205的真空干燥中干燥，即得成品，测定生物效价。所得产品可以自己进一步加工成针剂出售，也可以作为原料卖于国内外厂家生产。四、产品质量要求本项目的最终产品为人胰岛素，若作为其他药厂的生产原料，可以按其要求的质量要求生产。若是自己生产成成品，即人胰岛素针剂，则其生产的环境和过程应经过GMP认证,既符合我国中生物制品、无菌药品的各项要求,如其环境中的洁净室（区）空气洁净度要达到100级等.最终产品的分装规格可以参考目前以有的诺和灵的分装规格,其产品质量应该符合中精蛋白重组人胰岛素注射液的各项指标和检测要求。相关蛋白质的检查:取产品每1ml加9.6mol/L盐酸溶液3ul酸化后作为供品溶液；取供试品溶液50ul,照人胰岛素项下方法检查,总相关物质不得超过8%。五、经济效益生物工程影响生产能力的关键是发酵能力，本项目所得菌种的发酵能力可以较原有菌种提高50%，以通化东宝药业的人胰岛素项目为例:目前已经投入生产的年生产能力达到1000公斤,年平均销售收入67003万元,利润总额16061万元。而本菌种可以使生产能力至少提高30%,即可以增加年平均销售收入20000万元,利润总额5000万元左右,其经济效益十分可观。同时可以降低生产成本，进而增强产品的国际竞争力。六、经费预算研制高效人工合成胰岛素工艺的预算为100万元，主要用于研发、小试、中试，成品工艺。详细费用：研发 40万元小试 20万元中试 30万元成品工艺 10万元七、项目风险资金主要用于新菌种的研发，菌种研发成功后即可投入生产，可以使用目前已经比较完善的生产工艺和流程进行生产，无需大量改造生产工艺和流程，减少固定投资风险。同时最终产品仍为原产品人胰岛素制品，其从新进行临床试验以及新药证书的报批的时间相对于新药研发时间更短，从而进一步减少投