载体构建步骤.doc

一 载体酶切线性化（TOYOBO EcoR I）1.载体pCDNA浓度 0.8 ug/ul2.酶切体系（总50ul体系） pCDNA 3ul 10*H Buffer 5ul ddH2O 41ul EcoR I 1ul（8U/ul）3.反应条件 37C 1h 至多2h*已经试过37C过夜，本以为会酶切充分，但是不想把条带全切成小片段了，而且电泳后是一条宽宽的泳谱*另外，多次酶切证实，所加的酶量过多在酶切一小时的情况下仍然会出现酶切过度的情况，尽可能按照说明书上的量和时间做二 取2ul稀释成5ul于1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定有无条带及大小用大凝胶回收pcDNA（按2.5：1加入SYBR Green）电泳30min准备两支EPPendorf管，调60C水浴锅切胶 称重（1.5ml EPPendorf管重约0.82g）三 OMEGA gel purification kit回收pcDNA1.平衡柱子 加200ulBuffer GPS到DNA收集柱中，静置4min，12000xg*2min，加700ulDEPC处理H2O，12000xg*2min2.溶胶 按1ml/kg的比例加Binding Buffer到凝胶中3.60C水浴7mins，迅速转移至DNA收集柱中（至多700ul，超过的再转移一次），10000xg*1min，弃收集管中的液体4.加300ulBinding Buffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体5.加700ulwash Buffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体6.加350ulwash Buffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体7.最大转速（13000rpm）空转2min，弃收集管8.转移收集柱至1.5mlEPPendorf管，打开盖子静置2min9.加30ulElution Buffer静置2min，最大转速1.5min，弃收集柱10.取2ul稀释成5ul点胶*所加Elution Buffer的量是根据所纯化的产物的量来判断的，如果回收产物较多可以增加其量至50ul*纯化的理论效率为70%，如果先加一次Elution Buffer 20ul，静置2min，1000xg*1min,然后再加一次Elution Buffer20ul，静置离心。这样回收效率可以达到90%，不过终浓度会变稀四 去磷酸化处理（TOYOBO BAP）1.反应体系（总200ul） DNA 5-20pmoles10* Buffer 20ulBAP 2U（0.5U/ul）ddH2O Up to 200ul*做去p之前，必须得将之前的纯化物点胶以确信是否有完整的DNA，我已经在这个问题上吃过三次亏了，谨记！2.反应条件：37C 60min（5黏末端） 60C 60min（3黏末端，平末端）五 OMEGA gel purification kit回收去P处理过后的pcDNA，步骤同前，测浓度六 连接（Invitrogen-T4 DNA ligase）1.体系：5*Buffer 4ul 插入片段 9-90fmol 载体 3-30fmol ddH2O up to 19ul T4 DNA ligase 1ul*pcDNA片段大小5400bp，取载体终浓度为30fmol，则所需质量为30*10-15*660*5400g=0.1ug，所需插入片段的质量为0.1ug*3*基因bp数/5400=0.00556*bp数/1002.条件：粘性末端23-26C 1h（推荐） 或者16C过夜 平末端14C 24h3.终止：加1ul 0.5MEDTA，可保存于4C4.取部分反应产物稀释5倍用于转化感受态细胞 *3,4步可省略，转化时直接取产物2-3ul加入20-25ulToP 10转化*连接可以短时保存于4度，但是不宜久，当天的连接产物当天需转化*然后童教授推荐的加样量计算方法是：按照纯化物和pcDNA电泳图中亮度的比例来定，比如：3000和pcDNA的亮度比为1：1，为使插入片段和载体的终浓度（mol）比为4-10：1，则 基因 bp数 基因：pcDNA（mol比） 加样比（ul比） 3000 1590 (1/1590):(1/5400)=3.4mol:1mol 2-3ul：1ul为使转化的量较多，可以成倍加样，但是DNA终浓度过高会影响连接效率已经酶活性七 转化*开冰箱取TOP10前需做好其他相应的准备取一定量连接产物所加Top10的1-2%至1.5mlEPPendorf管中，20-200ul吸样枪，1-10ul吸样枪，EP管架，冰盒，计时器。1.取TOP10（一只TOP10为100ul装，可转化2-5样），计时5min2.分装20-50ul刚解冻的TOP10至各含有连接产物的EP管中3.冰浴20-30分钟 *准备42C水浴锅 *取出不含Amp的LB培养基平衡至室温 *取含Amp的LB培养皿放至37C恒温培养箱（需做蓝白斑筛选的需要在平衡至室温后加入16ul50ug/ulIPTG和40ul30ug/ulX-Gal）4.42C准确热激45-60sec5.冰浴2mins6.加250ul室温LB培养基7.150-200转/min 45min-1h *在取出EP管前5min准备灭菌涂玻棒8.取150-200ul摇菌产物均匀涂布于已温热至37C的含Amp的LB培养皿，37C培养过夜八 挑菌摇菌过夜准备：酒精灯，打火机，灭菌的摇菌管，镊子，泡沫底座，含Amp的LB培养基，1ml吸样枪，大Tip头，新近灭菌的小Tip头，记号笔，橡皮筋1.取灭菌的摇菌管于泡沫底座上，编号2.每管加入5ml含AmpLB培养基3.挑取散在的独立的直径在1-2mm间的菌斑至对应编号的摇菌管中4.37C 200转/min摇菌过夜*盖盖子并保持盖子不盖死以防细菌缺氧死掉*Tip头需要无菌，操作过程中尽量做到不污染，尤其不能污染培养基*童教授建议在挑菌的时候可以挑取不同大小的菌落*做载体构建的师兄提供信息说，一般可能6个菌落可以出来一个阳性的菌落，所以如果平板上的菌落在10个以内，那就全挑了吧*有人提出，考虑到阳性菌落少，为避免之后大量提取质粒酶切鉴定费时费力费money，而提出了菌落PCR，即将长出的菌落挑取到1.5mlEP管中200rpm*1h，之后去2ul菌落在100C沸水浴15min，用基因的上下游引物做PCR，但此只能做为初筛，引物P出来的东西并不能判断是来自重组的载体还是来自连接体系本身过剩的插入片段。但不排除将此方法作为初筛在减少成本方面功效明显不过我也在想另一个方法就是，我们的pcDNA多克隆位点两端是有T7和SP6的，我们可以T7和SP6做PCR，这样可以把来自原本过剩的插入片段完全排除在外，不过仅限于想法，尚未来得及验证！九 提质粒（TIANprep Mini 质粒小提试剂盒）1. 柱平衡步骤：向吸附柱CP3 中（吸附柱放入收集管中）加入500l 的平衡液BL，12,000 rpm 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中（请使用当天处理过的柱子）2. 取1-5 ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000 rpm离心1 分钟，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）3. 向留有菌体沉淀的离心管中加入250 l 溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀*如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低4. 向离心管中加入250 ul溶液P2，温和地上下翻转68 次使菌体充分裂解*温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA 片断*此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5 分钟，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量5. 向离心管中加入350 l 溶液P3，立即温和地上下翻转68 次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000 rpm离心10 分钟，此时在离心管底部形成沉淀*P3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清6. 将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3 中，注意尽量不要吸出沉淀。12,000 rpm离心30-60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3 放入收集管中7. 可选步骤：向吸附柱CP3 中加入500 l 去蛋白液PD， 12,000 rpm离心3060 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3 重新放回收集管中如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21， HB101，JM系列， ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5，TOP10 等），这步可省略8. 向吸附柱CP3 中加入700 l 漂洗液PW，12,000 rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中9. 向吸附柱CP3 中加入500 l 漂洗液PW，12,000 rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液10. 将吸附柱CP3 放入收集管中, 12,000 rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除*漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR 等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP3 开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液*漂洗液中含有乙醇，会将CP3上写的字给抹除掉，故应注意避免，或者在CP3上多写几个编号11. 将吸附柱CP3 置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100l洗脱缓冲液EB，室温放置2 分钟，12,000 rpm 离心1min将质粒溶液收集到离心管中*洗脱液的pH 值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH 值在7.0-8.5 范围内(可以用NaOH 将水的pH 值调到此范围)，pH 值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于50 l，体积过小影响回收效率。且DNA 产物应保存在-20，以防DNA 降解。十 酶切鉴定（TOYOBO EcoR I）体系分配，反应条件均同前*鉴定为阳性的结果要在所提的重组质粒管上标以红色记号