熊去氧胆酸.doc

熊去氧胆酸的活性及制备方法研究进展生物技术李冉熊去氧胆酸，主要成分是3a,7- 二羟基-5- 胆甾烷-24-酸，为有机化合物，无臭，味苦。本品在乙醇中易溶，在氯仿中不溶；在冰醋酸中易溶，在氢氧化钠试液中溶解。医学上用于增加胆汁酸分泌，并使胆汁成分改变，降低胆汁中胆固醇及胆固醇脂，有利于胆结石中的胆固醇逐渐溶解。基本信息中文名：熊去氧胆酸中文别名 3,7-二羟基-5-胆甾烷-24-酸;熊去氧胆酸;猪脱氧胆酸;异去氧胆酸;二羟基胆基酸;3,6-二羟基胆烷酸;二羟基胆烷酸（1）拼音名：Xiongquyangdansuan英文名：Ursodeoxycholic Acid英文别名 3alpha,6alpha-Dihydroxy-5beta-cholan-24-oic acid; Pig Hyodeoxycholic acid; 3,6-dihydroxycholan-24-oic acid; (3alpha,5beta,6alpha,8xi,9xi,14xi)-3,6-dihydroxycholan-24-oic acid; (3alpha,5beta,6alpha)-3,6-dihydroxycholan-24-oic acid; 4-(3R,5R,6S,10R,13R,17R)-3,6-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopentaaphenanthren-17-ylpentanoic acid; (3alpha,6alpha)-3,6-dihydroxycholan-24-oic acid; (3alpha,5beta,6alpha)-3,6-dihydroxycholan-24-oateCAS RN128-13-2EINECS号204-879-3分 子 式C24H39O4分 子 量391.5646书页号：2000年版二部1006 C24H40O4 392.58该品为 3a,7- 二羟基-5- 胆甾烷-24-酸。按干燥品计算，含C24H40O4不得少于98.5%。主要性状该品为白色粉末；无臭，味苦。该品在乙醇中易溶，在氯仿中不溶；在冰醋酸中易溶，在氢氧化钠试液中溶解。熔点：该品的熔点（2）为200 204。比旋度：取该品，精密称定，加无水乙醇溶解并定量稀释制成每1ml 中含40mg的溶液，依法测定（3），比旋度为+59.0至+62.0。临床作用长期服用本药可增加胆汁酸分泌，并使胆汁成分改变，降低胆汁中胆固醇及胆固醇脂，有利于胆结石中的胆固醇逐渐溶解，用于不宜手术治疗的胆固醇结石，但不能溶解胆色素结石、混合结石及不透X线的结石。对胆囊炎。胆道炎及消化不良亦有一定疗效。如何鉴别（1）取该品10mg，加硫酸1ml与甲醛1滴使溶解，放置5分钟后，再加水5ml，生成蓝绿色悬浮物。（2）该品的红外光吸收图谱应与对照的图谱一致.（3）检查异臭 取该品2.0g，加水100ml ，煮沸2分钟，应无臭。（4）氯化物取该品1.0g，加冰醋酸10ml，振摇使溶解，加水稀释至100ml ，摇匀，放置10分钟，滤过，取续滤液25ml，依法检查，与标准氯化钠溶液5.0ml制成的对照液比较，不得更浓（0.02%）。（5）硫酸盐 取上述氯化物项下剩余的滤液40ml，依法检查，与标准硫酸钾溶液2.0ml 制成的对照液比较，不得更浓（0.05%）。（6）有关物质 取该品，加氯仿-乙醇（9:1） 制成每1ml 中含 1.0mg的溶液，作为供试品溶液；另取鹅去氧胆酸对照品，加氯仿-乙醇（9:1） 制成每1ml 中含15g 的溶液，作为对照品溶液（1） ；再取胆石酸对照品，加氯仿-乙醇（9:1） 制成每1ml 中含1.0g的溶液，作为对照品溶液（2）。照薄层色谱法（4）试验，吸取上述三种溶液各10l ，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-丙酮-冰醋酸（7:2:1） 为展开剂，展开后，晾干，于120 加热30分钟，喷以20%磷钼酸的乙醇溶液，再在120 加热2 3分钟，立即检视。供试品溶液如显与对照品溶液 （1）相应的杂质斑点，其颜色与对照品溶液 （1）的主斑点比较，不得深；如显其他杂质斑点，其颜色与对照品溶液（2） 所显的主斑点比较，不得更深。其它信息干燥失重：取该品，在105 干燥2 小时，减失重量不得过1.0 %。炽灼残渣：取该品1.0g，依法检查，遗留残渣不得过0.2 %。钡盐：取异臭项下的溶液，加盐酸2ml ，煮沸2 分钟，放冷，滤过，并用水洗涤，洗液与滤液合并使成100ml ，摇匀；取10ml，加稀硫酸1ml ，不得发生浑浊。重金属：取炽灼残渣项下遗留的残渣，依法检查，含重金属不得过百万分之二十。砷盐：取该品1.0g，加水23ml溶解后，加盐酸5ml,依法检查，应符合规定（0.0002%）。含量测定取该品约0.5g，精密称定，加中性乙醇（对酚酞指示液显中性）40ml与新沸过的冷水20ml，溶解后，加酚酞指示液2 滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定，至近终点时，加新沸过的冷水100ml ，继续滴定至终点。每1ml氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）相当于39.26mg的C24H40O4。测定方法方法名称：熊去氧胆酸熊去氧胆酸的测定中和滴定法应用范围：该方法采用中和滴定法测定熊去氧胆酸（C24H40O4）的含量。该方法适用于熊去氧胆酸的测定。方法原理：取供试品适量，加中性乙醇（对酚酞指示液显中性）与新沸过的冷水溶解，加酚酞指示液，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定，每1mL氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）相当于39.26mg的C24H40O4，计算，即得。试剂：1. 水（新沸放置至室温）2. 中性乙醇3. 氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）4. 酚酞指示液5. 基准邻苯二甲酸氢钾仪器设备：试样制备：1. 氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）配制：取氢氧化钠适量，加水振摇使溶解成饱和溶液，冷却后，置聚乙烯塑料瓶中，静置数日，澄清后备用。取澄清的氢氧化钠饱和溶液5.6mL，加新沸过的冷水使成1000mL，摇匀。标定：取在105干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约0.6g，精密称定，加新沸过的冷水50mL，振摇，使其尽量溶解，加酚酞指示液2滴，用本液滴定，在接近终点时，应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解，滴定至溶液显粉红色。每1mL氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）相当于20.42mg的邻苯二甲酸氢钾。根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量，算出本液的浓度。贮藏：置聚乙烯塑料瓶中，密封保存；塞中有2孔，孔内各插入玻璃管1支，1管与钠石灰管相连，1管供吸出本液使用。2. 酚酞指示液取酚酞1g，加乙醇100mL使溶解。操作步骤：取该品0.5g，精密称定，加中性乙醇（对酚酞指示液显中性）40mL与新沸过的冷水20mL，溶解后，加酚酞指示液2滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定，至近终点时，加新沸过的冷水100mL，继续滴定至终点，每1mL氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）相当于39.26mg的C24H40O4。注1：“精密称取”系指称取重量应准确至所称取重量的千分之一，“精密量取”系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精度要求。注2：“水分测定”用烘干法，取供试品25g，平铺于干燥至恒重的扁形称瓶中，厚度不超过5mm，疏松供试品不超过10mm，精密称取，打开瓶盖在100105干燥5小时，将瓶盖盖好，移置干燥器中，冷却30分钟，精密称定重量，再在上述温度干燥1小时，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量，计算供试品中含水量（%）。一、熊去氧胆酸的药理活性研究摘要本文初步研究了熊去氧胆酸的药理活性。结果表明, 口服给药, 熊去氧胆酸能明显增加大鼠胆汁的分泌量、降低小鼠血清胆固醇和甘油三醋, 为木屏l的临床应用提供了实验依据。目前, 全世界约有三亿人患有胆石症。随着人民生活的改善, 饮食的变化, 我国胆道症患者日趋增加, 己逐渐成为威胁人民健康的一种常见病。因此研制吐道疾患防治剂具有屯要临床价值。胆石症中以胆固醇结石居首位, 鹅去氧胆酸与熊去氧胆酸均为有效的1 固醇结石溶解剂。尤其是后者, 具有剂址小、疗效高、 拼性小的优点 。我们以牛羊胆酸为原料, 川化学半合成法制备熊去氧胆酸, 填补了国内空皿, 为大量生产熊去氧胆酸提供了一条可行的工艺路线。本文对我们合成的熊去氧胆酸进行了初步药理活性研究, 为临床用药提供了依据。一、实验材料药品: 熊去氧胆酸, 由本室合成, m p 二1 94 1 9 8 , 用梭甲基纤维素钠配成20 % 混悬制剂。动物与给药途径: 雄性大鼠, 体重16 0 20 0 9 ， 小鼠雄性, 体重1 8 2 4 9 。灌胃给药, 对照组给生理盐水梭甲基纤维素钠混悬剂。二、方法与结果1 . 对胆汁分泌的影响采用胆道插管法, 取雄性大鼠14 只, 随机分为二组, 给药后30 分钟, 用20 % 鸟拉坦麻醉, 手术、插胆管, 收集二小时的胆汁分泌全匡。实验结果说明熊去氧胆酸较对照组有显著的利胆作用, 能明显增加胆汁的分泌屁(表1 )表1 熊去氧胆酸对大鼠胆汁分泌的影响 实验结果实验分组 实熊去氧胆酸剂量(m g /1c g ) 胆汁分泌量m l/ 小时(笼士S . D ) P对照组 生理盐水致甲基纤维索钠 1 。2 0 士0 。2 2给药组 103 1 。5 9 士0 。2 9 0 .0 52 . 对血清胆固醇的影响血清胆固醇的浓度测定采用高铁一硫酸显色法念。取小鼠16 只, 随机分为二组, 给药组和对照组各8 只, 连给药4 天于最后一次给药后5 小时, 摘除眼球取血, 制备血清后, 测定其胆固醇浓度。结果丧明, 给药组与对照组之间有非常显著的差异, 说明熊去氧胆酸对血清胆固醇有明显降低作用。( 表2 )表2 熊去氧胆酸对小鼠血清胆固醇浓度的影响实验分组 实验结果 熊去氧胆酸剂量（mg/kg） 血清胆固醇浓度m g / 1 OOm l( 牙士S . D ) P对照组 生理盐水狡甲基纤维素钠 5 2 。5 士7 。5给药组 400 3 9 。3 士4 。0 0 . 0 0 13 . 对血清甘油三酮的影响血清甘油三醋浓度的测定采用正庚烷一异丙醇混合液提取法。取小鼠16 只、随机分为二组, 给药组和对照组各8 只, 连续给药四天, 于最后一次给药后5 小时, 摘除眼球血, 制备血清, 测定甘油三醋。实验结果说明, 熊去氧胆酸对血清甘油三酷有非常显著的降低作用( 表3 ) 表3 熊去氧胆酸对小鼠血清甘油三醋浓度的影响实验分组 实验结果 熊去氧胆酸剂量(m g / k g ) 血清甘油三醋浓度m g / lo o m l(无士S D ) p对照组 生理盐水梭甲基纤维素钠 1 12 士1。0 给药组 400 4 9 土3 4 鹅去氧胆酸 U D CA 的顺序递减。赵春桂也指出U D C A 有镇痉和抗惊厥的作用(12。顾贤臣报道, 给服用熊胆的小鼠通以50 伏特的电流5 秒钟, 小鼠死亡率仅为2 7 . 3 %, 而生理盐水对照组的小鼠死亡率则为7 7 . 3 % , 提示熊胆的有效成分一U D C A 有较明显的抗惊厥作用1 3 。5、溶血作用和脂酶促进作用正田曾把U D C A 和其它胆汁酸进行了比较发现其溶血作用最弱, 此为U D CA 与其它胆汁酸所不同之处; 相反, U D CA 对脂酶促进作用很强, 能影响脂肪的消化与吸收, 其机制在于U D C A 强烈的表面活性作用。6、降血糖作用口服U D C A o . 4g / kg / d , 连续给药5 天, 能明显降低四氧嗯咤引起的家兔血糖的升高, 并可降低糖尿病患者的血糖和尿糖值, 无论单独及用或与胰岛素合用治疗糖尿病均有效( 14。七、毒理作用关于u D c A 副作用的报道很少, 其腹泻发生率很低, 仅为2 %, 迄今未发现任何用药后的肝脏损害,光镜和电镜观察亦未发现肝细胞与u D C A 一起孵育后有结构上的改变; 动物实验未发现U D CA 有诱发突变的作用。给小鼠饲以人用量50 倍剂量的U D C A , 其肝脏仅产生轻微的组织学变化15 。大鼠口服U D C A , 其L n 。值大于5 9 / k g综上所述, 近年来对U D C A 药理作用的研究已取得一定进展。u D C A 是一个理想的胆石溶解药物, 尤其对直径小于5 m m 的非钙化型胆石的治愈率相当高。R od a 等对2 23 例患者应用U D C A 后得出结论: 夕D C A 可作为溶解胆固醇型胆石的首选药物16)。另外, 近年来发现UD c A 有降血脂的作用, 值得进一步深入研究。三、熊去氧胆酸的新合成路线和方法的研究熊去氧胆酸是名贵中药熊胆所含的主要有效成分, 在临床上用于治疗各种胆疾及消化道疾病具有良好的效果17 , 熊胆的中药制剂在我国及东南亚, 已得到广泛的开发和利用. 但由于天然熊胆的来源日趋减少, 所以熊去氧胆酸的人工合成及半合成是一项急待解决的研究课题. 已报道的合成熊去氧胆酸的方法是从牛、羊的胆汁中提取、分离出牛胆酸18 , 经多步反应合成鹅去氧胆酸, 然后再经若干步反应转化为熊去氧胆酸, 其合成路线、工艺极为复杂; 本研究直接从鸡胆中分离提取鹅去氧胆酸, 然后选用高专一性复合型催化剂, 加氢还原制得熊去氧胆酸, 从而使合成路线和工艺大大简化, 产率提高, 成本降低.1材料和方法1. 1由鸡胆汁中提取鹅去氧胆酸首先将鸡胆汁经脱脂预处理, 用胆钙盐沉淀法脱去胆色素等杂质. 母液经碱性水解即得到鹅去氧胆酸等胆酸盐水溶液, 再经浓酸沉淀即分离析出鹅去氧胆酸. 除去水溶性及酸溶液杂质, 经沉淀、洗涤、干燥即得到鹅去氧胆酸粗品. 然后将粗品经柱层分离即得到鹅去氧胆酸纯品.1. 2由鹅去氧胆酸制备熊去氧胆酸本实验研究采用鹅去氧胆酸直接进行Jones 氧化, 然后其氧化物再进行催化氢化即得熊去氧胆酸, 其过程图示如下:以往的方法 4, 5 为鹅去氧胆酸的氧化物在催化加氢之前需要对羧基进行甲酯化保护, 再经Benkeser 反应加氢还原得到熊去氧胆酸甲酯, 最后再进行脱甲酯处理, 得到熊去氧胆酸. 本实验研究由于采用了只加氢还原羰基而对羧基不起作用的高专一性加氢催化剂, 所以不需要对羧基进行酯化保护, 因而省略了酯化、脱酯的二步化学反应步骤.2结果和讨论2. 1结果实验结果证明: 从鸡胆汁中提取鹅去氧胆酸的路线和工艺是可行的. 从鸡胆汁中提取鹅去氧胆酸粗品的提取率可达0. 7%以上, 粗品中鹅去氧胆酸的含量达80% 以上. 如果进一步完善总体实验方案, 进一步提高鸡胆汁的脱脂分离技术, 脱胆色素、胆固醇等物质的技术, 并进一步减少有效成分鹅去氧胆酸在整个处理过程中的损失量, 将有希望使粗品鹅去氧胆酸的提取率进一步提高到0.8% 以上, 粗品中鹅去氧胆酸的含量达到90% 以上.本实验研究中, 由鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸是对原有合成路线简化、改良后而制定的, 新的合成路线可使熊去氧胆酸的综合转化率由原合成路线的50%左右提高到65%以上. 如果再通过对加氢催化剂的优选及加氢反应条件的优化, 将能进一步提高熊去氧胆酸的综合转化率.2. 2二种合成法路线、工艺的比较( 1) 从牛、羊胆中制取熊去氧胆酸:牛、羊胆汁 水分解液 酸性沉淀胆汁酸胆酸 3, 7, 24- 三甲酯胆酸 3,7, 24- 三甲酯- 12- 酮基胆酸3, 7, 24- 三甲酯- 12- 羟氨氮基胆酸鹅去氧胆酸氧化物 熊去氧胆酸( 2) 从鸡胆中制取熊去氧胆酸:鸡胆汁水分解液酸性沉淀鹅去氧胆酸 氧化物熊去氧胆酸以上两种路线、工艺比较, 以牛、羊胆为原料制取熊去氧胆酸的路线和工艺比以鸡胆为原料的制取路线、工艺复杂一倍, 因此必然导致以牛、羊胆为原料所制得的产品产率低, 杂质含量高, 其相应的生产成本亦高. 所以从合成的路线、工艺上看以鸡胆为原料制取熊去氧胆酸是一种比较好的方法.2. 3几种不同工艺制品熊去氧胆酸的物理常数的比较:制成的产品及来源 M. P. / 比旋光度/ 纯品含量/ %用天然熊胆分离、精制的熊去氧胆酸 202 + 57. 07 100用鸡胆为原料合成的熊去氧胆酸 198202 + 53+ 57. 07 98. 5用牛、羊胆为原料合成的熊去氧胆酸 200204 + 59+ 62 98. 5从上表可以看出: 不同原料制得的熊去氧胆酸的物理常数在数值上有差异, 这主要是由于所用原料的主要成分的分子结构不同, 加之其加工方法和所用化工试剂的不同, 而导致最终产品中含有不同成分的微量副产品, 所以其物理常数亦不同. 比较来看, 用鸡胆为原料合成的熊去氧胆酸比用牛、羊胆为原料合成的熊去氧胆酸的M. P 和比旋光度更接近由天然熊胆精制的熊去氧胆酸.临床应用原发性胆汁性肝硬化(PBC）。PBC是主要发生于中年妇女的慢性进行性胆汁淤积性肝病，可能与免疫因素有关。Pares等进行了一项试验，平均活组织检查间隔时间为4.5年。结果发现，UDCA确能防止PBC组织学分期的进展。1999年Angulo等报道，在一项UDCA对非肝硬化PBC患者的长期治疗试验（平均6.6年）中，与接受无效治疗组患者相比，治疗组发生肝硬化的时间推迟。在大多数的UDCA治疗试验中，所用剂量为每日1315毫克/千克。最近的两项旨在探讨UDCA合适剂量的研究发现，每日1315毫克/千克和2025毫克/千克的剂量疗效均优于每日1015毫克/千克或以下。UDCA与甲氨喋呤或秋水碱联合治疗PBC的疗效并不优于单用UDCA；但与泼尼松或泼尼松加硫唑嘌呤合用，其改善炎症的疗效显著优于单用UDCA。原发性硬化性胆管炎（PSC）。PSC为一种罕见的胆汁淤积性疾病，表现为肝内外胆管狭窄和扩张。最近的一项由105例患者组成，治疗时间平均为2.2年的前瞻性随机安慰剂对照试验（UDCA每日1315毫克/千克）显示，患者的生化指标显著改善，临床症状和肝组织学均无显著变化。但对于明显的胆管狭窄，在内镜治疗的同时加用UDCA可以改善患者的预后。妊娠肝内胆汁淤积症（ICP）。ICP常发生于妊娠晚期，主要症状为，孕妇出现瘙痒、黄疸，可致早产、死胎、死产等并发症。认为是在遗传的基础上，与体内雌激素升高有关。一项UDCA治疗IPC的随机双盲安慰剂对照试验包括15例患者，治疗组瘙痒和肝生化指标有改善，8例孕妇（接受UDCA1.0克/天）在或近预产期分娩；而用安慰剂治疗的7例孕妇中有5例在孕36周分娩，其中1例为死胎。治疗期间未见母、婴副作用发生。因此，UDCA治疗ICP似乎是有效安全的。胆囊纤维化肝病（CF）。Colom鄄bo等在一项包括55例患者的随访双盲安慰剂对照试验中，将UDCA治疗（19）（每日15毫克/千克）1年后与安慰剂组进行比较。结果发现，治疗组症状、营养情况、生化指标等均显著改善。VandeMeeberg和SulliVan等报道，较高剂量UDCA（每日20毫克/千克）的疗效优于较低剂量（每日515毫克/千克）。慢性丙型肝炎。2001年有几项UDCA联合-干扰素治疗慢性丙型肝炎的随机安慰剂对照试验报道，治疗后生化指标改善，但对丙肝病毒（HCV)-RNA的清除无效，肝组织学特征也无改变。其他。有研究显示，UDCA与环孢素A及甲氨喋呤（20）合用治疗异型骨髓移植，UDCA能防止静脉闭塞和急性移植物抗宿主病的发生