（植物学专业论文）拟南芥ros1突变抑制因子的筛选、基因克隆及其功能分析.pdf

摘要 外源基因插入到植物基冈组中会引起本身或相关的内源基因发生转录水平的基因沉默 这种 转录水平的基因沉默的过程通常是由外源基闪产生s i r n a 再由这些s i r n a 介导d n a 甲基化及组 蛋自修饰变化等来实现 拟南芥中现已发现 很多r n a i 过程中的组件 d n a 甲基转移酶以及组 蛋白甲基转移酶等参与到这一过挥中 拟南芥中编码d n a 糖基化酶的r o s l 基因突变后能够使多 拷贝的转基因p r o p d 2 9 a l e 和内源r d 2 9 a 基因的启动子区发生超甲基化 从而使内源r d 2 9 a 基因 及外源 c 转基因表现出转录水平的基因沉默现象 而与其相邻的转基因p r o j 5 s n p t l l 的启动子 区的甲基化虽没有发生变化但却同样表现出转录水平的基冈沉默 r o s i 基因作为一种d n a 去甲 基化酶参与抑制转录基因沉默过程中 利j j r o s l 突变体中沉默的p r 0 3 j s jn p z 噼 基因作为筛选标记 我们从e m s 诱变的r o s l 后代中筛 选到了一系y o r o s t 突变的抑制因子 其中r o r s u p p r e s s o ro f r o s l 突变体包括两个等位突变 r o r l 一 h r o r l 2 r o r l 基因的突变能够使r o s l 突变背景中处丁沉默状态的p r o j 珂 p h 基因恢复表达 但 是对p r o r o jl u c 基因的沉默状态却没有影响 基冈组亚硫酸氢盐测序及拟南芥基因组s o u t h e m b l o t 分析结果显示突变体中r d 2 9 a 启动子区整体甲基化情况不受r o r l 突变的影响 并且基冈组中 r d n a 区和着丝粒区的d n a 甲基化也不受r o r l 突变的影响 另外 n o r t h e r nb l o t 分析发现r o r l r o s l 突变体中内源转座子t 研的表达量却比r o s l 突变体和c 2 4 野生型 r o s l 突变体的背景 都高 通过 对转基因p r o j 5 s n p t i i 的启动子区的甲基化及组蛋闩修饰的分析显示 虽然c 2 4 野生型 r o s l 突 变体及r o s l r o r l f 突变体中转基因p r 0 3 jn p 弛珀勺3 船启动子区甲基化情况没有变化 但是相对于 r o m 突变体 r o r l r o s i 突变体中该区域组蛋白h 3 k 9 的二甲基化程度降低了 而组蛋白h 3 的乙酰 化程度则升高了 这说明r o r l 突变引起的转基冈p m j 镕j p m 区域基因沉默的释放与d n a 甲基化 变化无关而与组蛋白的修饰状态的变化有关 另外 r o r lr o s l 突变体表现出明显的发育上的异常 表型 如植株矮小 早花等 一些突变体在发育晚期还出现末端花结构异常的表型 基因定位的 结果显示尺 尺 基因编码一个拟南芥d n a 复制蛋 t a 2 r p a 2 a a t 2 9 2 4 4 9 0 r o r l r p a 2 a 基因 在根失及茎尖的分生组织表达量较高 r o r l r p a 2 a 基因突变会影响根尖及茎尖顶端分生组织细 胞的分裂 但是对细胞最终的大小没有影响 亚细胞定位结果显示 r o r l r p a 2 a 蛋白定位于细 胞核内 该基因突变后突变体植株对d n a 烷化剂甲基甲磺酸 m m s 超敏感 说明r o r i r p a 2 a 基因在d n a 修复过程中起重要作用 由丁二r o s l 蛋白也具有d n a 修复的活性 并且酵母般杂交体 外实验证明了r o r l r p a 2 a 蛋白与r o s l 蛋向的互作关系 我们推测r o r l r p a 2 a 蛋白的d n a 修 复功能很可能与r o s l 蛋白相关 而其在基因沉默方面的调节功能则具有相对独立性 我们的研 究揭示了拟南芥d n a 复制蛋白a 2 在维持特殊区域的组蛋向修饰模式和转录水平的基因沉默过程 中以及在拟南芥顶端分生组织发育过程中的重要作用 关键词 d n a 甲基化 组蛋白修饰 r o s l 突变体 r o r l r o s l 突变体 r o r l r p a 2 a 基因 r o s l 基 因 a b s t r a c t t h ef o r e i g ng e n e si n t e g r a t e di n t op l a n tg e n o m e sa n dt h e i re n d o g e n o u sh o m o l o g o u sg e n e so f t e n b e c o m es i l e n c e da tt h et r a n s c r i p t i o n a ll e v e l t h i sk i n do ft r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n gi su s u a l l y t r i g g e r e db ys i r n a sd e r i v e df r o mt h ef o r e i g ng e n e s r n a d i r e c t e dd n am e t h y l a t i o na n dh i s t o n e m o d i f i c a t i o na r ei n v o l v e di nt h i sp r o c e s s m a n yl i n e so fe v i d e n c es u g g e s tt h a ts o m ee n z y m e sa sr n a p r o c e s s i n gf a c t o r s d n am e t h y l t r a n s f e r a s e s a n dh i s t o n e m e t h y l t r a n s f e r a s e s a r ei n v o l v e di n t r a n s c r i p t i o n a lg a n es i l e n c i n g m u t a t i o n si nad n ag l y c o s y l a s e l y a s eg e n er o s lc a u s et r a n s c r i p t i o n a l g e n es i l e n c i n go ft h ep r o r d 2 9 a l u c i f e r a s e u 9 3t r a n s g e n ew i t hr d 2 9 ap r o m o t e rh y p e r m e t h y l a t i o n a n do ft h el i n k e dt r a n s g e n e p r s s n p t l lw i t hn oa p p a r e n tm e t h y l a t i o nc h a n g eo f3 5 sp r o m o t e ri n a r a b i d o p s i st h a l i a n a r o s lg e n ep a r t i c i p a t e si nt h ep r o c e s so ft r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n gb y d e m e t h y l a t i n gt h et a r g e tp r o m p t e rd n a w es c r e e n e df o rs u p p r e s s o r so fr o s lu s i n gt h es i l e n c e dp r 0 3 5 s n p t i ig e n ea sam a r k e ra n di d e n t i f i e d2 a l l e l i cm u t a n t s r o r l 一 a n dr o r l 2 s u p p r e s s o ro f o s l m u t a t i o n si n r o r ir e a c t i v a t et h es i l e n c e d p r 0 3 j s n p t i ig e n eb u tn o tt h ep r u m 2 9 a l u ci nt h er o s lm u t a n t g e n o m i cb i s u l f i t es e q u e n c i n ga n d s o u t h e r nb l o td a t ai n d i c a t ed n am e t h y l a t i o ni nr d n a c e n t r o m e r i cd n a a n dr d 2 9 ap r o m o t e rr e g i o n s i sn o ta f f e c t e d b yr o t l t h ee n d o g e n o u st s i t r a n s c r i p t i o n a l l ys i l e n ti n f o r m a t i o n t r a n s c r i p t sa r e e x p r e s s e da tah i g h e rl e v e li nt h er o r lr o s lm u t a n t sc o m p a r e dw i t hr o s o rt h ew i l dt y p e u s i n gd n a m e t h y l a t i o ns e n s i t i v er e s t r i c t i o ne n z y m ea n a l y s i sa n dg e n o m i cb i s u l f i t es e q u e n c i n g w ed i dn o td e t e c t a n yd n am e t h y l a t i o nd i f f e r e n c ei nt h e3 5 sp r o m o t e ra m o n gt h et h r e eg e n o t y p e s c 2 4 r o s la n d r o s l r o r l c h r o m a t i ni m m u n o p r e c i p i t a t i o nd a t as u g g e s tt h a th i s t o n eh 3a c e t y l a t i o ni si n c r e a s e da n d h i s t o n eh 3 k 9d i m e t h y l a t i o ni sd e c r e a s e di nt h e3 5 sp r o m o t e ri nr o r lr o s lc o m p a r e dw i t hr o s l t h e s e r e s u l t si n d i c a t et h a tr e l e a s i n go fs i l e n c e dp r 0 3 5 s n p t i ib yr o r lm u t a t i o n si sr e l a t e dt oh i s t o n e m o d i f i c a t i o n b u tn o tt h ed n am e t h y l a t i o n t h er o r lr o s im u t a n t sa r es m a l l e t f l o w e re a r l i e r a n ds o m e o ft h e ms h o wat e r m i n a lf l o r a ls t r u c t u r e m a d b a s e dc l o n i n gr e v e a l e dt h a tr o r le n c o d e sa3 1 k d a p r o t e i ns i m i l a rt od n ar e p l i c a t i o np r o t e i na 2 r p a 2 a a t 2 9 2 4 4 9 0 r o r l r p a 2 ai se x p r e s s e dm o r e s t r o n g l yi ns h o o ta n dr o o tm e r i s t e m s m u t a t i o n si nr o r lj r p a 2 aa f f e c tc e l ld i v i s i o ni nm e r i s t e m sb u t n o tf i n a lc e l ls i z e s r o r i r p a 2 ap r o t e i ni sl o c a l i z e di nt h en u c l e u s t h er o r l r p a 2 am u t a n ts h o w s i n c r e a s e ds e n s i t i v i t yt od n aa l k y l a t i n ga g e n tm e t h y lm e t h a n e s u l p h o n a t e m m s i n d i c a t i n gt h a t r o r l r p a 2 ai sa l s o r e q u i r e d f o rd n ar e p a i r w e s u g g e s t t h a tt h ed n ar e p a i rf u n c t i o no f r o r l r p a 2 a m a yb er e l a t e dt ot h ed n ar e p a i ra c t i v i t yo fr o s 1s i n c er o r l r p a 2 a p h y s i c a l l yi n t e r a c t sw i t hr o s 1 o u rw o r ku n c o v e r st h ei m p o r t a n tr o l e so fd n a r e p l i c a t i o np r o t e i n a 2i nm a i n t a i n i n gt g si ns p e c i f i cl o c ia n di nt h er e g u l a t i o no f m e r i s t e r md e v e l o p m e n ti np l a n t k e yw o r d s d n am e t h y l a t i o n h i s t o n em o d i f i c a t i o n r o r jm u t a t i o n r o r lr o s lm u t a n t r o r l r p a 2 a g e n e r o s lg e n e l i a m d b s c a m v 3 5 s c l c h i p c t a b d e p c d m s o e b e d l a e m s e s t g f p g s t g u s h p t i p t g k b k d k a n m m s m s n p t i l n t o r f p c r r a m r i f r n o s e s a m s n p s s d s s s l p s t a e t e 1 l i s x g a l 缩略词表 m n p i c i l l i n b i s u l f i t es e q u e n c i n g c a m v 3 5 sp r o m o t e r t r i c h l o r o m e t h a n e i s o a m y la l c o h o l c h r o m a t i ni m m u n o p r e c i p i t a t i o n c e t y l t r i m et h y l a m m o n i u mb r o m i d d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d i m e t h y ls u l f o x i d e e t h i d u mb r o m i d e e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a u c e t i ca c i d e t h y lm e t h a n e s u l f o n a t e e x p r e s s i o ns e q u e n c et a g t h eg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n g l u t a t h i o n e e s t r a n s f e r a s e g l u c u r o m i d a s e h y g r o m y o i np h o s p h o t r a n s f e r a s e i s o p r o p y l b d t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e k i l o b a s e k i l o d a l t o n k a n a m y c i n m e t h y lm e t h a n e s u l f o n a t e m u r a s h i g e s k o n gm u d i u m n e o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s e n u c l e o t i d e o p e nr e a df r a m e p o l y m e r e a s ec h a i nr e a c t i o n r o o ta p i c a lm e r i s t e m r i f a m p i c i n r i b o n u e l e a s e s h o o ta p i c a lm e r i s t e m s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s i m p l es e q u e n c el e n g t h p o l y m o r p h i s m s t r i s a c e t i ca c i dg l a c i a l e d t a 1 l i s e d l a t r i s h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e 5 b r o m o 4 一c h l o r o 3 一i n d o l y l b d g a l a c t o s i d e v 氨苄青霉素 皿硫酸氢盐测序 花椰菜花叶病毒启动子 氯仿 异戊醇 染色质免疫共沉淀 r 六烷基三甲基溴化胺 焦碳酸 乙脂 二甲基弧砜 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 甲基磺酸乙酯 表达序列标签 绿色荧光蛋白 谷胱甘肽s 转移酶 葡萄糖苷酸酶 潮霉索磷酸转移酶基因 异丙基硫代 b d 半乳糖苷 千碱基 千道尔顿 卡那霉素 甲基甲磺酸 m s 培养基 新霉素磷酸转移酶基因 核苷酸 开放阅读框 聚合酶链式反应 根尖分生组织 利福平 核糖核酸酶 茎尖分生组织 单个核苷酸多态性 十二烷基磺酸钠 简单序列长度多态性 t r i s 乙酸 e d t a 缓冲液 i r i s e d t a 缓冲液 三羟甲基氨基甲烷 5 溴 4 氯 3 吲哚 b d 半乳糖苷 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果 也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己存论文中作了明 确的说明并表示了谢意 研究生签名 曩然 时间 2 驴 6 年6 月御日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借阅 可以采用影印 缩印或扫描等复 制手段保存 汇编学位论文 同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表 传播学位论文的全部或部分内容 保密的学位论文在解密后应遵守此协议 研究生签名 妻 粤支 时间 加 占年易月彬日 导师签 时间 以钟6 年6 月呼日 中国农业大学博 学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述 基因表达调控机理的研究是分子生物学研究的基本课题之一 尤其是在人类 小鼠 水稻 拟南芥等基冈组测序完成之后 了解基因的表达调控机理将有利于人们更深入地解释细胞分化 组织癌变 个体发育和衰老等一系列生物现象 为人类了解生命活动的本质 解释细胞行为以及 生命体备种变化的发生机理提供可靠的理论依据 k 期以来 人们一直认为生物体的遗传性状完全由d n a 序列决定 但是后来发现在基因序列 不改变的情况下 生物体的表型也会发生变化 基冈的沉默和表达状态是由什么凋控的 基因作 为遗传单位在生物个体生长发育过程中又是如何作州i 呢 随着研究的深入 人们对生物体的生物 学过程有 更多的认识 除了那些基冈组中d n a 的初级序列外 更高 级的染色质的组织状态 在基因表达的决定模式中扮演关键角色 包裹较松散的常染色质区更容易发生转录过程 而紧密 包裹的异染色质区则很难被转录 因此 相同的基因序列可以根据其忙于常染色质区或异染色质 医而处于表达或转录沉默状态 表观遗传学的英文表达形式 e p i g e n e t i c s 中的 e p 的意思 是 在上 向e 即指这种基冈表达的控制过程是基于染色质的组织状态 而非d n a 的序列组 成 目前认为 表观遗传学研究的是那些非d n a 序列的变化而形成的基因功能的改变 这种改变 又可伴随细胞的有丝分裂和减数分裂过程遗传下去的现象 r u s s o e t a l 1 9 9 6 异染色质区域的序列一般包括着丝粒相关的重复区 核糖体r n a 编码的重复区以及转座子元 件序列等序列重复的区域 r i c h a r d s ej a n d e l g i n s c 2 0 0 2 植物体中 异染色质区域的形成 一部分取决于d n a 序列上胞嘧啶5 位上的甲基化 5 m e c 这种修饰是在d q a 复制完成历由胞 嘧啶甲基转移酶催化完成的 d n a 复制后 甲基转移酶催化将s 腺苷酰 l 甲硫氨酸 s a m 上的甲 基基团连接 i j d n a 分子的腺瞟呤碱基或胞嘧啶碱基的5 位上 进行d n a 修饰过程 5 位上被甲基化 的胞嘧啶位于b 型d n a 结构的火槽中 处丁裸嚣的状态 这一状态有利于d n a 结合蛋白的识别 特异的蛋白与甲基化的d n a 序列结合后 为染色质修饰复合体的聚集提供了一个平台 在这个平 台上染色质修饰复合体将甲基化的区域组装成异染色质 b i r d 2 0 0 2 d n a 半保留复制完成后共价的胞嘧啶甲基化修饰能够遗传到两条子代染色体中的一条 从而 为亲本d n a 上的甲基化提供了一个表观遗传上的印迹 在半甲基化的子4 e d n a 分子中 甲基化的 印迹会在新合成的d n a 链上再次建立 因此 一旦甲基化形成 即使最初产生甲基化的刺激已经 不存在了 亲本的甲基化状态仍然可以在一种以半甲基化d n a 为底物的 维持 甲基化的甲基转 移酶的作用下被永远地保留下来 t a r i q m a n dp a s z k o w s k i j 2 0 0 4 植物基因组中甲基化印迹 的丢失在d n a 复制完成之后 维持原先印迹的功能遭到了破坏 另外还有一种可能是部分区域发 生去甲基化过程 c u ia n d f e d o r o i t 2 0 0 2 g o n g e t a l 2 0 0 2 区别真核生物常染色质和异染色质的两个决定因素除了胞嘧啶甲基化的出现和消失过程外 还有组蛋白的修饰状态 组蛋白是构成真核生物染色质基本单位的核小体的组成成分 真核生物 的核小体是d n a 和组蛋白分子所组成 核小体的核心由组蛋白h 2 a h 2 b h 3 h 4 各2 分子 形成的八聚体和缠绕在八聚体上的1 7 5 圈的大约1 5 0b pd n a 所组成 组蛋白八聚体是染色质中 最基本的蛋白组件 每个核心组蛋白包含两个结构域 组蛋白的折叠区与组蛋白间相互作用及缠 中国农业大学博士学位论文 第一章史献综述 绕d n a 有关 氨基末端结构域则位于核小体核心结构以外 像一条 尾巴 在几个不同的赖氨酸 丝氨酸以及精氨酸残基的位置能够被翻译后修饰 并可同其他调节蛋白和d n a 相互作用 j e n u w e i na n d a l l i s 2 0 0 1 虽然组蛋白在进化过程中是高度保守的 但是它们会因为翻译后的 各种修饰而发生动态的变化 典型的组蛋白 尾巴 修饰包括乙酰化 甲基化 磷酸化以及泛素 化等 这些组蛋白修饰组台起来就形成了所谓的组蛋白密码 h i s t o n ec o d e j e n u w e i na n d a l l i s 2 0 0 1 和动物以及多数真菌一样 植物体中的常染色质与组蛋白h 3 n h 4 的超乙酰化以及组蚩 白h 3 i l h 4 上的赖氨酸的甲基化相关 异染色质则与组蛋向h 3 i i h 4 的超乙酰化以及组蛋f 1 h 3 k 9 的甲基化相关 c h u a e ta 1 2 0 0 1 g e n d r e l e ta 1 2 0 0 2 s o p p e e la l 2 0 0 2 哺乳动物在胚胎发育早期便会抹击或蘑建基冈组甲基化模式 而植物体则不同 这就为解决 胞嘧啶甲基化及染色质结构的表观遗传修饰如何改变基因的表达状态提供了便利的研究平台 y o d e r e ta 1 1 9 9 7 植物还能够通过减数分裂将表观遗传变化传递给后代 现有的研究结果显 示 由表观遗传修饰所引起的基冈表达调控过程与d n a 甲基化 组蛋白修饰以及d x r n a 的活动密 切相关 这三者之间存在着错综复杂的联系 对三者关系的理解将有助于人们了解生命活动的本 质及规律 1 1d n a 甲基化的建立与维持 1 1 1 d n a 甲基化的功能 植物核基因组的胞嘧啶甲基化作用一般发生在着丝粒重复区 编码核糖体r n a 的重复区以及 转鹰子元件序列等序列重复的区域 因此植物基因组中整体5 m e c 的数量与基因组中重复序列的 数量相一致 t a r i q m a n dp a s z k o w s k i j 2 0 0 4 并且在植物基因组甲基化的区域中 5 c g 3 甲基化修饰是最普遍的形式 但是也观察到了5 一c n g 3 n 代表任何核苷酸 和c h h 位点 不对 称的位点 h 可以是a c 或t 的甲基化修饰 o a k e l e ya n dj o s t 1 9 9 6 动物中的d n a 甲基化作 用儿乎都局限在对称的g c 序列上 只有小鼠胚胎干细胞中发现了其它序列上的甲基化现象 b i r d 2 0 0 2 r a m s a h o y e e la 1 2 0 0 0 遗传分析显示 植物基因组中不同的甲基化形式代表着不 同的胞嘧啶甲基转移酶的不同作用底物 因此 在一定区域内不同形式的甲基化的密度也反映了 不同甲基转移酶在这些区域中的效率 d n a 复制完成后 甲基转移酶催化s 腺营酰 l 甲硫氨酸 s a m 上的甲基基团连接n d n a 分子 的腺嘌呤碱基或胞嘧啶碱基上 即完成了d n a 甲基化过程 内源基因的d n a 甲基化主要发生在基 因5 省 启动子区域 而外源基因的甲基化则可从启动子区域开始一直延伸至基因结构的3 端 d n a 甲基化过程在生物体中的生命过程中扮演重要的角色 动植物中的d n a 甲基化主要有两 个作t h j 一是防御基因组中转座子的活动 另一个就是调节基因的表达 人们发现删由上百 个拷贝的一前一后排列的基因组成 一般情况下这些r d n a 基因是被甲基化的 处于沉默状态 在甲基化抑制剂的作用下 这些沉默的基因会恢复活性 l a w r e n c e e ta 1 2 0 0 4 与发育相关的 基因表达也会受到甲基化作用的调节 转录因子f w a 的转录起始区域重复序列的甲基化使其只在 胚乳中表达 而在植物的其它器官中保持沉默状态 而在胚乳中的表达也只发生在该处的d n a 甲 2 中国农业大学博十学位论文第一章文献综述 基化被去除之后 k i n o s h i t a e t a l 2 0 0 4 s o p p e e t a l 2 0 0 0 另外 d n a 甲基化还控制着重复序列 家族基因的整体表达情况 b e n d e ra n df i r 1 9 9 5 在植物体中 一些基因启动子区的d n a 甲基 化通常能够抑制转录过程 而编码区的甲基化一般不会影响基因的表达 j o n e s e t a l 1 9 9 9 p a r k e t a 1 1 9 9 6 s t a m e t a i 1 9 9 8 有一些基因并不遵循这一规律 例如s u p e r m a n s u p u 4 g a 0 堪 一g 由于这些基因转录区域存在重要的控制元件 故在这些基因转录区域发生的d n a 甲基化 会导致转录终i l s i e b u r t ha n dm e y e r o w i t z 1 9 9 7 i t o e la 1 2 0 0 3 最近的基因芯片研究发现在一 砦基冈的3 端存在新的c g 甲基化位点 但是这些基冈以及其生物学功能尚不清楚 t r a n e t a 1 2 0 0 5 1 1 2d n a 甲基化的建立 d n a 甲基化过程的一个关键问题是在基因沉默建立过程中特异序列是如何被识别的 在对 植物体的研究中发现 d n a 甲基化可以被 j r n a 所介导 晟早的证据来自丁对携带有r n a 类病 毒的转基因烟草的研究 w a s s e n e g g e r e ta l 1 9 9 4 当病毒处于活跃的复制期时 转基冈序列区 域出现甲基化的积累 而在没有病毒复制的植株中 则没有发现转基因序列的甲基化现象 这种 现象在其它的r n a 病毒系统中也被观察到 这种由 j r n a 介导的d n a 甲基化过稗被称之为r d d m r n a d e p e n d e dd n am e t h y l a t i o n 参与r d d m 过程的d r n a 是由r n a i 过程产生的 r n a i 是真核生物抵御双链r n a 的一种反应 在r n a i 过程中 较k 的双链r n a 分子首先被一种称为 d i c e r 的核酸酶切割成2 2 n t 2 5 n t 欧度的 小片段 在r n a 解旋酶的作用下解旋形成单链的d x r n a 这些小片段r n a 与蛋白多聚体r i s c 结 合 引导r i s c 复合体去降解序列互补的m r n a f i r ea n dm e l l o 1 9 9 8 事实上 单链的类病毒和 r n a 病毒经由双链r n a 为中间产物的复制过程能够成为r n a i 过程的靶序列 a n g e l la n d b a u l c o m h e 1 9 9 7 d a l m a y e t a l 2 0 0 0 来源于病毒的s i r n a s 被认为能够引起同源序列的d n a 甲基 化 r d r 6 r n a d e p e n d e n t r n a p o l y m e r a s e 6 基因 s g s 3 s d e 2 s u p p r e s s o r o f g e n e s i l e n c i n g3 s i l e n c i n g d e f e c t i f e 2 基因以及s d e 3 s i l e n c i n g d e f e c t i v e3 基因的突 变削弱了由病毒引起的基因沉默现象 同时由高转录的正义转基因引起r n a i 类似的沉默过程也 受影响 m o u r r a i n e ta 1 2 0 0 0 d a l m a y e la 1 2 0 0 1 d a l m a y e ta 1 2 0 0 0 r d d m 导致r n a d n a 序列同源区域几乎所有胞嘧啶高密度的从头甲基化 因触发因子的序 列不同 r d d m 可导致蛋白编码区的甲基化或启动子区的甲基化 在蛋白编码区对称胞嘧啶的甲 基化可能对转录无干涉作用 冈此对基因表达调控并不重要 j o n e sa n dt a k a i 2 0 0 1 但是 如 果蛋白编码区所有胞嘧啶都发生甲基化 转录延伸也会被终止 在真菌中甲基化诱导早熟的现象 中就属于这种情况 f a u g e r o n 2 0 0 0 高密度甲基化d n a 模板导致的转录提前终l r 可能是异常小 r n a 的来源 这些异常t j r n a 可作为r n a 依赖的r n a 聚台酶r d r p 的底物 而这种酶对植物的转 录后基因沉默 p t g s 脉孢菌的基因阻抑和秀丽隐杆线虫的r n a i 是必需 c h i c a sa n d m a c i n o 2 0 0 1 因此 蛋白编码区持续的r d d m n 6 j 通过合成d s r n a 所需的模板澈活p t g s 通路 对 于由启动子区产生的小r n a 引发的沉默 根据特定启动子胞嘧啶甲基化的敏感度不同以及在启动 子区形成抑制性染色质构象的效率不同 可产生一种高度稳定的转录抑制状态 因此 与转录后 基因沉默过程相比 通过转录水平基因沉默过程更容易获得有丝分裂遗传能力和沉默都相对稳定 中国农业大学博士学位论文 第 苹史献综述 的体细胞 事实上 在转基因或r n a 病毒产生的双链触发r n a 消失厉 其引发的r d d m 和t g s 依 然可以通过减数分裂得到遗传 j o n e sa n dt a k a i 2 0 0 1 p a r k e ta l 1 9 9 6 这种情况f 减数分裂 后残留的甲基化主要位于c g h c n g 位点 在维持性d n a 甲基转移酶活性作用下这一现象还可增 强 一些d n a 甲基转移酶参与r d d m 过程一p 的甲基化建立 植物中d r m d o m a i n s r e a r r a n g e d m e t h y l t r a n s f e r a s e 蛋自家族与哺乳动物的从头甲基转移酶d n m t 3 d n a 5 c y t o s i n em e t h y l t r a n s f e r a s e 家族虽然在蛋白催化区域的氨基酸序列不同 但是它们却是由同一 个始祖基网进化而来的 c a n e t a l 2 0 0 0 植物体中d r m 家族包括d r m l 1 1 d r m 2 其中d r m 2 被认为在d n a 从头甲基化过程中起主要作用 c a o e ta l 2 0 0 0 c a oa n dj a c o b s e n 2 0 0 2 1 c a oa n d j a c o b s e n 2 0 0 2 2 d r m 蛋白参与f 黝和s 俨肼e 心 基冈座的从头甲基化过程 但是对于甲基化 的维持不起作用 c a oa n dj a c o b s e n 2 0 0 2 2 并且d r m l d r m 2 双突变体中f 阡爿和舣 尸e r 利 基因座 上的非c g 位点无法进行从头甲基化过程 c a oa n dj a c o b s e n 2 0 0 2 2 在f w a 基因首尾相连重复排 列的情况下 转入片段的d n a 从头甲基化过程还需要包括r d r 2 r n ad e p e n d e n tr n a p o l y m e r a s e d c l 3 d i c e r l i k e3 r p d l r n ap o l y m e r a s edj 以及a g 0 4 a r g o n a u t e 4 等活性在内的完整的s i r n a 生成途径 c h a n e ta l 2 0 0 4 h a m i l t o n e l a l 2 0 0 2 x i e c ta 1 2 0 0 4 r n a 沉默相关基因的突变能完全掩盖从头甲基转移酶d r m l d r m 2 双突变体的表 型 这说明由s i r n a g i 起的d n a 甲基化作用能够延伸到插入序列以及病毒序列之外 植物体中每个r n a i 相关蛋白都有很多同源基因编码 冈此很难去验证是否所有的d n a 从头 甲基化都是由s i r n a 日 起的 更复杂的是 由于d c l l 基因 i i a g 0 1 基因在m i c r o r n a 介导的胚胎发 育的调节中起重要作用 这两个基因的突变体均表现出发育上的缺陷 s c h a u e ge ta 1 2 0 0 2 v a u c h e r e t e ta l 2 0 0 4 插入重复序列的转录所引起的d n a 从头甲基化过程并不需要a g 0 4 的作 用 但是却完全依赖于d r m 甲基转移酶的作崩 z i l b e r m a n e ta 1 2 0 0 4 c a n e ta l 2 0 0 3 对于这 样的现象 有观点认为冗余的s i r n a 产生途径能够引导d r m 甲基转移酶到达插入重复序列和同源 基因序列的位置 不同长度的s i r n a 的存在以及它们各自行使的不同生物学功能为这样的观点提 供了有力的依据 d c l 3 途径产生的主要是2 4 n t 的s i r n a 这种s i r n a 直接引起d n a 甲基化 而由 一种未知的d i c e r 产生的2 i n t 的s i r n a 贝i j 主要参与m r n a 的降解 也能引导由病毒和高转录的正义 转基因引起的d n a 甲基化过程 h a m i l t o n e ta l 2 0 0 2 x i e e la 1 2 0 0 4 致于s i r n a j t 1 何引导d r m 甲基转移酶到达特异序列区域进行从头甲基化过程有儿种不同的 观点 一种观点认为 基网组d n a 处于松散的状态 从而有易于s i r n a 的结合 另一种认为 基 因的转录产物产生新生的r n a 这种r n a 能够与s i r n a 形成碱基互补 并将包括染色质修饰酶类 录i d r m 甲基转移酶在内的复合体限制在给定的位点上 酵母中的实验为这种 监督转录过程 模 型提供了一些有力的证据 s u g i y a m a e t a l 2 0 0 5 m o t a m e d i e l a l 2 0 0 4 另外 植物中特异的d n a 依赖的r n a 聚合酶i v p o l l v 的发现支持了一种以r n a 转录为基础的观点 该酶在s i r n a 介导 的d n a 甲基化过程中起重要作用 h e r r e ta 1 2 0 0 5 o n o d e r a e ta 1 2 0 0 5 s d e 4 又名r p d l 编 码p o li v 的大亚基 其与参与r n a i 过程中的其它基因r d r 2 d c l 3 和a g 0 4 共同行使功能 产生 的s i r n a 直接指导d r m 甲基转移酶 c h a n e ta 1 2 0 0 4 h a m i l t o n e ta 1 2 0 0 2 4 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 1 1 3d n a 甲基化的维持 d n a 甲基化的维持和从头起始甲基化过程都必需涉及 l j r d d m 般认为只要存在触发 r n a 在r n a d n a 相互作用区域几乎所有的胞嘧啶都会在从头起o 口d n a 甲基转移酶的催化下发 生甲基化 如果去掉r n a 信号 只有在d n a 甲基转移酶的持续作用f d n a 甲基化才会持续存 在 在任何给定时间里 由r d d m 日 起的甲基化方式只取决于可用的r n a 信号利存在的d n a 甲基 转移酶的种类 d n a 甲基化过程中 目前了解最清楚的是胞嘧啶甲基转移酶 无论是在细菌中还 是在真核生物中这一类酶都具有一些保守的蛋白结构域 其中包括一个甲基结合何点 一个靶 d n a 结合位点以及一个半胱氨酸催化活性位点 凌位点能催化嘧啶环6 位上的亲核攻击使甲基基 团易于结合在5 位上的 b e s t o r 2 0 0 0 c h e n g 1 9 9 5 除了这些催化区域 真核生物的胞嘧啶甲基 转移酶还带有伸展着的氨基末端序列以便于使其定位到基因组中的合适区域 植物中鉴定到三组结构不同的胞嘧啶甲基转移酶 一m e t c m t 录i d r m f i n n e g o n g t a 1 2 0 0 0 这三组酶在植物不同的甲基化维持机制中行使功能 1 1 3 1c g 位点d n a 甲基化的维持 拟南芥中发现的d n a 甲基转移酶m b t h y l t r a n s f e r a s el m e t l j 与哺乳动物中的胞嘧 啶甲基转移酶d n m t l 有着相似的c 末端催化区域 f i n n e g a n e t a l 1 9 9 3 哺乳动物中的d n m t i 是维 持c g 位点d n a 甲基化的酶 b e