_嗜酸耐热菌的测试方法-doehler.doc

德乐食品饮品配料（上海）有限公司 Doehler Food & Beverage Ingredients (Shanghai) Co., Ltd.文件名称Document Name微生物品控操作手册文件类型Document Type作业指导书Working Instruction生效日期Effective date文件编号 Document No.版本号Version No.页码Page2012.8.23DL-WI-LD-003034 of 4 起草人Prepared By审阅人Reviewed By批准人Approved By 1、 目的Purpose:本文件规定了微生物检测的方法. 2、适用范围Scope: 适应于果汁和果汁浓缩液、水等的微生物的检验。3、 职责Responsibility1）微生物检验员按各产品规格书和检验方法的要求执行日常的检验工作；2质量部经理负责日常检验工作的督导。4.程序 Procedure:4.28 嗜酸耐热菌的测定方法. 4.28.1定量分析-涂布法（适用于浊汁类）4.28.1.1 无菌吸取10ml样品加入90ml无菌水中。4.28.1.2 放进801水浴锅里热激活样品10分钟。4.28.1.3 冰水浴冷却样品至4045 4.28.1.4 用无菌吸管吸取1ml样品分别移入2个做好的YSG或BAT平板表面。4.28.1.5用无菌涂布棒将样液在平板上涂抹均匀4.28.1.6 将涂抹好的平板平放于桌上2030min。4.28.1.7 如果菌液不能很好地渗透入培养基里，则将平板平放在45培养箱里培养一天，再倒过来放进塑料自封袋中。4.28.1.8 放在451的培养箱中培养至少5天4.28.1.9 观察并报告。1）读取平板上的菌落数，结果以：菌落数*10/ml表示；2）若平板没有任何菌落形成，记成：10 cfu/ml.4.28.2定量分析膜片分析法（适用于清汁类）4.28.2.1无菌吸取10ml样品加入装有50ml无菌水的灭菌瓶里。4.28.2.2 放在801水浴锅里热激活样品10分钟。4.28.2.3 冰水浴冷却样品至40454.28.2.4 组装已灭菌的抽滤装置，安上0.45微米的滤片，打开真空泵，将灭菌瓶里的样液进行抽滤，再用30ml无菌水冲洗，取出滤片，平放在做好的YSG或者BAT-平板上。4.28.2.5 将平板倒着，放进塑料自封袋中，451的培养箱中培养至少5天。4.28.2.6 观察并报告。1）读取平板上的菌落数，结果以：菌落数*/10ml表示；2）若平板没有任何菌落形成，记成：1 cfu/10ml.4.28.3定性检测（适用于一切果汁） 4.28.3.1无菌吸取浓缩果汁10ml加入90ml BAT-Bouillon；RTD(糖度小于15白利度的果汁，无菌吸取50ml加入50ml BAT-Bouillon (Doehler 2.04717.782)。 4.28.3.2 放在801水浴锅里热激活样品10分钟 4.28.3.3冰水浴冷却样品至40454.28.3.4 放进451的培养箱中培养至少3天4.28.3.5 然后用接种环吸取足够量的培养后的样品，在做好BAT平板中划线；同时接种足够量的培养后的样品，在做好的PCA平板上划线。4.28.3.6 将划好线的BAT和PCA平板放在塑料自封袋中，倒放入451的培养箱中培养至少5天4.28.3.7观察并报告。1）若PCA划线有菌落生长，则不管BAT板上划线有无菌落生长，都判断无嗜酸耐热菌。2）若PCA划线无菌落生长，而BAT板上划线有菌落生长，则判断有嗜酸耐热菌，并须做愈创木酚实验。.4.28.4 愈创木酚实验：如果YSG/BAT琼脂平板上有菌落生长须做愈创木酚实验：4.28.4.1 愈创木酚测试盒（试剂盒存放于黑暗干燥处） 1)40个培养管（2mL 诱发培养液） 2)溶液1：50mL 缓冲液，pH 4.0 3)溶液2：900uL H2O2溶液（蓝色瓶盖） 4)溶液3：酶试剂 （褐色小瓶褐色盖）。在第一次使用前用900uL 蒸馏水均匀溶解。酶制剂制备后应当储存在2-8C且在3-4个月必须用完。5)溶液4:2份愈创木酚标样（黄色瓶盖，1050ppm 愈创木酚） 4.28.4.2. 测试4.28.4.2.1 样品：1)将足够量的被检菌落用灭菌接种环接种到BAT-诱发培养液中，451C培养24小时。 2)将1mL 溶液1加入到培养管中，摇匀。 3)加入20uL 溶液2 4)加入20uL 溶液3(稀释后的)。 5)摇匀培养管中的溶液，室温下放置5-10分钟。 4.28.4.2.2阴性空白试验步骤同8.6.2.1， 但不接种菌落。 4.28.4.2.3 阳性空白试验：1)加入40uL 溶液4 到BAT-诱发培养液中。 2)加入1mL 溶液1 3)加入20uL 溶液2。 4)加入20uL 溶液3。 摇匀培养管中的溶液，室温下放置5-10分钟。 观察培养管内对照溶液颜色的变化。 4.28.4.3 分析: 4.28.4.3.1 如果样品颜色变化显著且褐色色泽深于阴性空白，表明检测到饮料中有致败的嗜酸耐热菌，其产生使饮料变异味的物质（愈创木酚） 的风险很大。 4.28.4.3.2 如果培养管和阴性空白的颜色变化相同，则表明饮料中没有致败嗜热耐酸菌存在或产生异味物质的风险很低。 4.28.4.3.3 如果颜色变化不明显，则建议增加培养时间到24小时。 附：愈创木酚测试颜色变化:1 2 3 4 5 51, negative con