分子生物学常规实验方法.doc

实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化【实验目的】熟悉利用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的操作及质粒转化大肠杆菌的方法。【实验原理】当大肠杆菌生长到OD600约为0.20.4时，用冰冷的氯化钙低渗溶液处理大肠杆菌细胞，细胞膨胀成球形，可使大肠杆菌进入一种易于接受外源DNA的状态（感受态），处于此状态的细胞称为感受态细胞（competent cells）。此时，若在感受态细胞中加入质粒，则质粒DNA与Ca2+形成的复合物粘附于细胞表面，经过42短暂的热激处理后，DNA与Ca2+形成的复合物进入大肠杆菌细胞，在不含抗生素的培养基中短暂培养，使转入大肠杆菌质粒上的抗生素抗性基因表达，在含相应抗生素的选择培养基上可将转化菌（含质粒）与未转化细菌分开，转化细菌经过不断分裂增殖形成菌落，而未转化的细菌则不能。【器材与试剂】1实验仪器 培养箱，恒温摇床，超净工作台，低温台式离心机，分光光度计，水浴锅，高压灭菌锅，微孔滤器（含0.22m滤膜），酒精灯 2实验试剂 氯化钠（AR），无水氯化钙（AR），蛋白胨，酵母提取物，1.0 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，琼脂粉，LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g， 800 mL蒸馏水溶解后，用NaOH溶液调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，121高压灭菌20 min；LB固体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g， 800 mL蒸馏水溶解后，用1.0 mol/L NaOH调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，然后加入琼脂粉15 g，121高压灭菌20min，分别倒入无菌培养皿。若配制选择性培养基，当温度降至60左右时，加入1 mL氨苄青霉素溶液（100mg/mL），混匀，分别倒入无菌培养皿；CaCl2溶液：准确称取无水氯化钙11.1 g，用双蒸水溶解，并定容至1 000 mL，121高压灭菌20 min，4保存；氨苄青霉素钠溶液：准确称取氨苄青霉素钠0.5 g，用蒸馏水溶解并定容至5 mL，用微孔滤器过滤除菌后，分装于Eppendorf管中，-20保存。3.实验材料 E.coli DH5, pUC18质粒【实验步骤】1接种大肠杆菌单菌落于2 mL LB液体培养基中，37振荡（约250r/min）培养过夜。2. 将2 mL过夜培养物转接到盛有100 mL的LB液体培养基的500 mL三角瓶中，37继续振荡培养至OD600约为0.20.4（约2 h）。3取1 mL培养物于一灭菌的Eppendorf 管中，冰浴放置1030 min，4，1 500g离心5 min，弃上清。4沉淀用0.2 mL冰冷氯化钙溶液轻轻悬浮，冰浴放置15 min，4，1 500g离心5 min，弃上清。5沉淀再用0.2 mL氯化钙溶液轻轻悬浮，放置在冰浴中，制成大肠杆菌感受态细胞。6. 取5 L pUC18质粒(不超过10 ng)，加入制好的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min。7. 42 热激90 s后，迅速置于冰浴5 min。8. 加入800 L培养基，37 振荡（100 r/min）温育1 h，使pUC18上的氨苄青霉素抗性基因得以表达。9. 取200 L涂布于含氨苄青霉素钠 (100 g/mL)的LB固体培养基上, 正向放入37培养箱中培养1 h，再倒置培养过夜至菌落清晰，统计菌落数量。【注意事项】1 应使用处于对数生长期的大肠杆菌细胞，OD600最好不超过0.4。2 整个实验最好在低温环境下进行，以获得较高的转化效率。3 每次悬浮沉淀细胞要轻缓，避免剧烈振荡。【实验作业】根据质粒的用量，计算本实验制备感受态的转化率（cfu/g DNA）。参考文献1 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 北京：高等教育出版社，1993. 2872892 刘进元等. 分子生物学实验指导. 北京：清华大学出版社，2002. 22253 Cohen SN, Chang ACY, Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: Genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. Proc Natl Acad Sci USA, 1972,69:21104. 魏群.分子生物学实验指导.北京：高等教育出版社，1999.5355实验二 质粒的提取与琼脂糖凝胶电泳分析【实验目的】熟悉碱法提取质粒以及DNA的琼脂糖电泳分析的原理和方法。【实验原理】在碱性条件下，染色体DNA发生变性，共价闭合的质粒DNA仍为自然状态。当溶液调至中性且有高浓度的盐存在条件下，变性的染色体DNA交联成不溶性的网格结构，变性的染色体DNA与蛋白质发生共沉淀，而质粒DNA仍存在于上清液中，通过离心去除沉淀，溶液中的质粒DNA可被异丙醇沉淀。DNA在碱性的电泳缓冲溶液中因带负电荷，电泳时向正极移动，不同DNA的电泳迁移率与其分子长度与形态有关，DNA分子越大，则迁移率越小，因此，通过电泳可将不同长度的DNA分子分开。【器材与试剂】1实验仪器 细菌培养箱，控温摇床，高压灭菌锅，微量移液器，高速台式离心机，电泳仪，水平电泳槽，紫外分析仪，pH计，微波炉2实验试剂 琼脂粉，100 mg/mL 氨苄青霉素钠，氯仿，异丙醇，70% 乙醇，琼脂糖，溴化乙锭，20 g/mL RNase A， LB液体培养基，溶液I：50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA, 25 mmol/L Tris-Cl缓冲溶液（pH8.0）；溶液II：0.2 mol/L NaOH，1% SDS；溶液III: 3 mol/L 醋酸钾，5 mol/L 醋酸；TE缓冲溶液：10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0),1 mmol/L EDTA；TAE缓冲溶液（50）：2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA,pH8.0；载样缓冲溶液（10）：0.25% 溴酚蓝，30%甘油。3实验材料 转化pUC18的大肠杆菌（E.coli DH5），DNA/EcoR I, Hind III【实验步骤】一、质粒的提取1从平板上挑取转化pUC18的大肠杆菌的单菌落，接种于20 mL 含100 g/mL 氨苄青霉素钠的LB液体培养基中，37 ，振荡（250 r/min）培养过夜。2取1.2 mL培养物置于Eppendorf管中，10 000 rpm离心1min，弃上清。3沉淀菌体用0.1 mL溶液I重新悬浮，加入0.2 mL溶液II，颠倒数次至溶液变得澄清，最后加入0.15 mL溶液III，轻轻颠倒Eppendorf管数次，10 000 rpm离心10 min。4上清液移入一个新的Eppendorf管中，加入0.2 mL氯仿，快速颠倒数次，10 000 rpm离心10 min，将上清液移入另一个Eppendorf管中，加入等体积异丙醇，混匀，10 000 rpm离心10 min，弃上清。5向管中加入0.5 mL 70%乙醇，10 000 rpm，离心2 min，弃上清，室温挥干酒精，加入20 L 含20 g/mL RNase A 的TE缓冲溶液溶解DNA。二、琼脂糖凝胶电泳1称取1 g 琼脂糖，加入TAE缓冲溶液（1）100 mL，微波炉加热熔化，配制 1%琼脂糖凝胶，稍微冷却后，倒入制胶模具，插好梳子，待胶凝固后，拔出梳子。2将凝胶连同制胶模具放入电泳槽，倒入TAE缓冲溶液（1）使溶液没过胶面，取9 L提取的质粒与1 L栽样缓冲溶液混合，用微量移液器点加到凝胶的加样孔内。380100 V 电泳，当溴酚蓝移动到距凝胶下边沿约1cm处时，停止电泳。4将凝胶浸泡在含0.5 g/mL溴化乙锭的TAE缓冲溶液（1）中染色30 min，于紫外分析仪内观察结果。【注意事项】1 质粒提取过程中，加入溶液II和溶液III后，要混匀，但动作要轻缓。2 质粒沉淀后，由于量比较少，贴在管壁上，在洗涤时不要将其移走。【实验作业】1 说明溶液I、溶液II和溶液III的作用是什么？2 在琼脂糖凝胶上，哪一条带为超螺旋DNA？为什么？参考文献1 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 北京：高等教育出版社，1993. 1071082刘进元等. 分子生物学实验指导. 北京：清华大学出版社，2002. 110实验三 重组DNA分子的构建【实验目的】熟悉DNA的酶切、片段回收、DNA连接、转化以及重组子的筛选的方法。【实验原理】DNA经限制性内切酶切割成大小不同的片段，电泳分离后，切胶回收目的片段，琼脂糖凝胶用高浓度的NaI溶液溶解后，玻璃奶（glass milk）可以吸附DNA，去除NaI后，用无菌水或TE缓冲溶液解吸附，获得DNA片段。回收的酶切质粒DNA与目的DNA片段，在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，构建重组子，重组子转化大肠杆菌后，提取重组DNA分子进行酶切鉴定或利用其它方法如-互补进行筛选。【器材与试剂】1实验仪器 细菌培养箱，恒温摇床，超净工作台，台式离心机，水浴锅，高压灭菌锅，微量移液器，电泳仪，电泳槽，紫外分析仪2实验试剂 氯化钠（AR），蛋白胨，酵母提取物，氨苄青霉素钠，EcoR I, Hind III, 酶切缓冲液（买酶附赠），琼脂糖，TAE缓冲溶液（50），玻璃奶（glass milk）， NaI溶液（溶胶液）： 称取NaI 90.8 g, Na2SO3 1.5 g，用无菌水溶解并定容至100 mL，4，避光保存；乙醇洗涤液：50 mL乙醇中含 20 mmol/L Tris-Cl (pH7.4), 1 mmol/L EDTA，0.1 mol/L NaCl, -20保存；灭菌双蒸水，T4 DNA连接酶，T4 DNA连接酶缓冲液（购酶附赠），载样缓冲溶液（10），X-gal溶液：20 mg 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal） 溶于1 mL二甲基甲酰胺中；异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）溶液：1 g IPTG 溶于4 mL双蒸水，定容至5 mL，微孔滤器除菌，-20保存3实验材料 E.coli DH5, pUC18质粒，DNA/EcoR I, Hind III【实验步骤】一、DNA的酶切20 L酶切体系含：2 L 酶切缓冲液，5 L pUC18质粒（ 约2g），1 L EcoR I ，1 L Hind III, 11 L 无菌双蒸水。离心5 s, 混匀，37酶切30 min1 h。 二、电泳分离1 配制1%的琼脂糖凝胶，方法同前一实验。2. 20 LDNA/EcoR I, Hind III（约2 g）和酶切体系中分别加入2 L载样缓冲溶液（10），混匀，分别加样，电泳，具体方法如前一实验。2 将凝胶在溴化乙锭染色液中染色30 min。三、DNA回收1在紫外灯下将含线性pUC18质粒DNA和947 bp DNA片段的凝胶分别切下置1.5 mL Eppendorf管中, 加入3倍于凝胶体积的NaI溶液溶解，50水浴溶胶，间或摇动，至凝胶完全溶解。2加入10 L玻璃奶，混匀，室温放置5 min，8000 rpm离心1 min，弃上清。3沉淀用0.2 mL 的乙醇洗涤液悬浮，8000 rpm离心1 min，弃上清。4重复操作35. 将Eppendorf管开口于室温放置至玻璃粉变白，加入20 L 无菌双蒸水悬浮，50水浴保温5 min。6. 10 000 rpm离心5 min，分别取出上清置于一Eppendorf管。四、DNA 连接120 L连接体系含：7 L回收的pUC18质粒DNA，10 L回收的DNA片段，2 L T4 DNA连接酶缓冲液，1 L T4 DNA连接酶。2 1216条件下，连接过夜。五、转化配制LB液体和固体培养基，方法同前。制备含100 g/mL氨苄青霉素钠的LB培养基固体平板，将20 L X-gal 和4 L IPTG均匀涂布在每一平板表面，37，放置1 h。. 取10 L连接产物转化E.coli DH5感受态细胞，取200 L转化产物涂布在平板上，37培养过夜，观察菌落数量和颜色。【注意事项】1 溶胶的时候，一定要使凝胶溶解彻底，以免连接产物在1216条件下重新凝固。2 操作过程中乙醇洗涤液一定要挥发干净，否则影响随后的连接反应。【实验作业】1 如果实验过程中进行的是单酶切，如何防止质粒的自身连接？2 利用-互补进行阳性克隆筛选的原理是什么？白色菌落含有重组子，还是蓝色菌落含有重组子？参考文献1. 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 北京：高等教育出版社，1993. 131, 3002刘进元等. 分子生物学实验指导. 北京：清华大学出版社，2002. 11213. 朱玉贤，李毅. 现代分子生物学（第二版）. 北京：高等教育出版社，2002. 153实验四 聚合酶链式反应扩增DNA【实验目的】熟悉通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，简称PCR）体外扩增特定DNA片段的技术原理和实验方法。【实验原理】PCR是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促DNA合成反应。反应分为三步：（1）变性（denaturation）: 双链DNA在高温条件下解开成单链；（2）退火（annealing）:当温度降低时，引物与单链模板DNA 的特定序列结合；（3）延伸（extension）: DNA聚合酶以单链DNA为模板，按照碱基互补配对原则，从引物的3端按照53方向合成新链。以上述三步为一个循环，每个循环合成的DNA都可作为下一个循环的模板，经过多个循环后，特定的DNA片段数量可以增加到2n倍。 本实验根据噬夏孢欧文氏菌（Erwinia uredovora）基因组中的crtE序列（crtE编码牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶，参与类胡萝卜素的合成），设计一对引物，从基因组中扩增该基因。【器材与试剂】1实验仪器 PCR仪，微量移液器，电泳仪，DNA电泳槽，紫外分析仪2实验试剂 Taq DNA聚合酶，PCR缓冲溶液（10），10 mmol/L dNTP 混合液，DNA/EcoR I, Hind III，琼脂糖，DNA载样缓冲溶液(（10），溴化乙锭染色液，TAE缓冲溶液（50）3 实验材料 噬夏孢欧文氏菌基因组DNA，PCR专用薄壁管引物1：5-GAATTCCATATGACGGTCTGCGCAAAAAAAC-3引物2：5-ATTCTCGAGTTAACTGACGGCAG-3【实验步骤】1在0.2 mL的PCR薄壁管中加入下列组分配成20 L反应体系：2 L PCR缓冲溶液（10），1 L引物1（0.5 mol/L），1 L引物2（0.5 mol/L），1 L dNTP 混合液，1 L Taq DNA 聚合酶，1 L噬夏孢欧文氏菌基因组DNA（约10 ng），13 L 无菌双蒸水。2PCR参数设为：94预变性5 min，94变性45 s，52退火45 s，72延伸1 min，共进行35个循环，最后72保温10 min。3用1TAE配制1%琼脂糖凝胶。4 在PCR反应体系中加入2 L载样缓冲溶液，混合后，上样电泳。5 将凝胶用溴化乙锭染色30 min，于紫外分析仪内观察结果。【注意事项】1本实验PCR反应体系应充分混合均匀。2应根据选购Taq DNA 聚合酶公司提供的使用说明，选择合适的PCR缓冲溶液，有的缓冲液中添加了Mg2+，有的则没有。【实验作业】影响PCR扩增产物特异性的因素有哪些？参考文献1. 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 北京：高等教育出版社，1993. 4084172Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al. Short protocols in molecular Biology( 3rd ed.). John Wiley & Sons, Inc. 1995. 15-13. 汪靖超，孙东平，杜桂彩等. 噬夏孢欧文氏菌（Erwinia uredovora）类胡萝卜素合成相关基因crtE的克隆及其在大肠杆菌中的表达. 食品科学，2007，28（7）：276279实验五 植物基因组DNA的制备与纯度分析【实验目的】熟悉植物基因组DNA的提取及其纯度的鉴定方法。【实验原理】植物材料经过液氮粉碎，提取液中阳离子型去垢剂十六烷基三甲基溴化铵(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide，简称为CTAB)能溶解细胞膜和核膜，解聚核蛋白，且与DNA形成复合物，在高盐条件下，该复合物是可溶的。用氯仿等有机溶剂抽提，可使蛋白质变性，使多糖沉淀，经过离心， CTAB-DNA复合物仍保留在上清液中，降低盐浓度，则CTAB-DNA复合物发生沉淀，沉淀用高盐TE缓冲溶液溶解后，加入异丙醇，CTAB仍在溶液中，但DNA发生沉淀，沉淀溶于TE缓冲溶液中，即得植物基因组DNA。DNA纯度分析常用的方法有琼脂糖凝胶电泳分析法和紫外分光光度法两种。纯净的DNA溶液是透明的，用紫外分光光度计测定其在260 nm和280 nm处的吸光度，OD260/OD280值约为1.8，若二者比值大于1.8，表明样品中含有较多的RNA，若比值小于1.6，则说明样品中含有较多的蛋白质或酚类等杂质。【器材与试剂】1实验仪器 台式高速冷冻离心机，微量移液器，水浴锅，液氮罐，陶瓷研钵，紫外分光光度计，高压灭菌锅2实验试剂 -巯基乙醇，乙醇，异丙醇，CTAB提取液：2% CTAB，0.1 mol/L Tris-Cl,pH8.0，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，20 g/mL RNase A ，室温保存；CTAB/NaCl溶液：4.1 g NaCl溶解于80 mL蒸馏水，缓缓加入10 g CTAB， 边加热边搅拌至溶解，用蒸馏水定容至100 mL；CTAB沉淀溶液：1% CTAB，50 mmol/L Tris-Cl,pH8.0，10 mmol/L EDTA，pH8.0, 室温保存；氯仿/异戊醇（24：1，v/v）：按24:1的体积比配制，4保存；高盐TE缓冲液：10 mmol/L Tris-Cl,pH8.0，0.1 mmol/L EDTA，1 mol/L NaCl，高温灭菌后室温保存；TE缓冲液：10 mmol/L Tris-Cl, 1 mmol/L EDTA，pH8.0，高温灭菌后室温保存。3实验材料 新鲜的烟草叶片【实验步骤】1向一定量的CTAB提取液中加入-巯基乙醇至终浓度为2%（v/v），并在水浴锅中将溶液升温到65。2称取1 g烟草叶片，放在用液氮预冷的研钵内, 倒入液氮迅速研磨成粉末，转入无菌的离心管。3 加入 4 mL预热到65的CTAB提取液，混匀，65水浴中保温1060 min，间或摇动。4. 向上述离心管中加入4 mL氯仿/异戊醇，颠倒离心管数次，4 ，10 000 g离心10 min，取上清转移到另一个离心管中。5. 向上清中加入1/10体积预热到65的CTAB/NaCl溶液，颠倒离心管数次。然后加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒离心管数次，室温条件下，10 000g离心10 min，取上清转移到一个新离心管中。6向上清液中加入2倍体积的CTAB沉淀溶液，颠倒离心管数次，室温条件下，10 000g离心5 min，弃上清。7沉淀用0.5 mL高盐TE缓冲液溶解,然后转移到一无菌Eppendorf管中。若沉淀难于溶解，则可将离心管放在65水浴中处理30 min。8向盛有DNA溶液的Eppendorf管中加入0.6 mL的异丙醇，混匀，4 ，10 000g离心15 min，弃上清。9沉淀用0.5 mL 80%乙醇润洗一次，室温干燥，加入0.1 mL TE缓冲液溶解沉淀，得DNA溶液。10取5 L DNA溶液加无菌水至4 mL，放入石英比色皿，用紫外分光光度计测定其在260 nm和280 nm处的吸光度，计算OD260/OD280，判断所提取DNA的纯度。【注意事项】1 实验时应尽量选用酚含量较低植物的幼嫩组织。2 若加入CTAB沉淀溶液后无沉淀析出，表明盐浓度较高，应用CTAB沉淀溶液继续稀释。【实验作业】1影响所提取DNA质量的因素有哪些？2依据该方法提取的DNA在基础研究领域有何应用？参考文献1.王关林，方宏筠.植物基因工程原理与技术.北京：科学出版社，1998，3703752Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al. Short protocols in molecular Biology( 3rd ed.). John Wiley & Sons, Inc. 1995. 2-10 实验六 植物总RNA提取与琼脂糖凝胶电泳分析（也可以用第三版上的内容）【实验目的】熟悉植物总RNA提取及提取RNA质量的琼脂糖凝胶电泳分析方法。【实验原理】用含有异硫氰酸胍变性剂的提取液抽提植物组织粉末，一方面可以和-巯基乙醇联合作用高效抑制RNase的活性，防止RNA的降解，另一方面又可使蛋白质变性并使其溶解，在酸性条件，提取液进一步经过酚/氯仿抽提去除蛋白质、DNA、多糖等杂质，RNA可被异丙醇沉淀。【器材与试剂】1实验仪器 高速冷冻离心机，陶瓷研钵，液氮罐，微量移液器，电泳仪，电泳槽，紫外分析仪，水浴锅，烘箱2实验试剂 提取液：4 mol/L异硫氰酸胍，25 mmol/L柠檬酸钠（pH 7.0），0.5 十二烷基肌氨酸钠，0.1 mol/L -巯基乙醇；醋酸钠溶液（2 mol/L ,pH 4.0），水饱和苯酚（pH 3.5），氯仿/异戊醇（24：1，v/v），乙醇，异丙醇，焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，简称DEPC），琼脂糖，甲醛，10电泳缓冲溶液：200 mmol/L吗啉代丙磺酸（pH7.0），20 mmol/L醋酸钠，10 mmol/L EDTA（pH8.0），过滤除菌后避光保存；5载样缓冲溶液：16 L水饱和溴酚蓝，80 L 0.5 mol/L EDTA（pH8.0），720 L 37%甲醛，2 mL甘油，3.084 mL甲酰胺，4 mL 10电泳缓冲溶液，加DEPC处理过的水至10 mL,4保存；0.5 g/mL溴化乙锭染色液（1电泳缓冲溶液配制）3. 实验材料 新鲜的烟草叶片【实验步骤】 一、RNA的提取1. 取两只10 mL离心管，各加入3 mL冰冷的提取液，置于冰上。 2. 取0.5 g新鲜的烟草叶片组织放在液氮预冷的研钵中，倒入液氮，迅速研磨成粉末。 3. 将粉末移入盛有提取液的离心管中，振荡，使植物材料和溶液充分混合，后将离心管置于冰上。 4. 向离心管中依次加入0.3 mL醋酸钠溶液、3 mL水饱和酚和1 mL氯仿/异戊醇，快速颠倒离心管数十次，冰上放置15 min。 5. 4，12 000g离心30 min, 将上层水相转移到另一个离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，-20静置30 min。 6. 4,12 000 g离心20min，弃上清，倒置离心管使溶液尽可能流干，沉淀重新溶于0.7 mL提取液，4,12 000 g离心10min，上清移入一1.5 mL Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，混匀后，-20静置30 min。 7. 4，12 000g离心30min，弃上清，沉淀用70乙醇润洗一次，用微量移液器吸走乙醇溶液，室温放置使残留乙醇挥发干净，加入50 L DEPC处理的水溶解，得RNA溶液。 二、变性琼脂糖凝胶电泳1称取1.5 g 琼脂糖，加入DEPC处理的水72 mL，加热溶化后，冷却到5060，再依次加入10电泳缓冲溶液10 mL和甲醛18 mL，混匀后制胶。2取16 L RNA溶液放入一Eppendorf管中，加入4 L 5载样缓冲溶液，65保温5 min，迅速置于冰上，上样前短暂离心。3点样后，80V恒压电泳，溴酚蓝迁移超过凝胶的1/2处时停止电泳。4 凝胶用溴化乙锭染色液染色30 min，紫外等下观察。【注意事项】1为尽可能的避免RNA的降解，实验所用玻璃器皿洗净后必须于烘箱内于180烘烤8 h以上，所用的溶液及塑料器皿必须用DEPC处理，操作环境尽量干净。2. 为了减少RNase污染并避免DEPC、溴化乙锭、甲醛等对人体的毒害，实验过程中应戴手套操作，并经常更换。【实验作业】1 如何判断所提取的RNA是否完整？2 电泳上样前，为什么要对RNA样品进行处理？参考文献1 王关林，方宏筠.植物基因工程原理与技术.北京：科学出版社，1998，6082 刘进元等. 分子生物学实验指导. 北京：清华大学出版社，2002. 57663 J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著. 分子克隆实验指南（第三版）.黄培堂等译. 北京：科学出版社，2002，540实验七 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达【实验目的】熟悉异丙基-D 硫代半乳糖苷（Isopropyl-D-thiogalactopyranoside，简称IPTG）诱导外源基因在大肠杆菌中表达的原理和方法。【实验原理】在E.coliBL21(DE3)染色体DNA中插入了T7 RNA聚合酶基因，该基因的上游为Lac启动子，在正常条件下，大肠杆菌Lac操纵子中LacI编码的阻遏蛋白结合在该Lac启动子以及pET-15b 质粒T7启动子的附近LacO上，抑制T7 RNA聚合酶基因的表达，从而抑制了pET-15b 上T7启动子下游外源基因的表达。当培养基中存在 IPTG时，IPTG与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白成为非活性形式，解除了阻遏蛋白对Lac启动子和T7启动子的抑制，T7 RNA聚合酶基因表达，它与T7启动子结合诱导其下游外源基因的转录，转录产生的mRNA经过翻译表达出目的蛋白。本实验选用的工程菌为转化了pET-15bcrtE的E.coliBL21(DE3)。pET-15crtE是通过将噬夏孢欧文氏菌（Erwinia uredovora）编码牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶的crtE，在Nde I和Xho I位点克隆到pET-15b中而构建的，crtE的起始密码子（ATG）与pET-15b上的多聚组氨酸标签（His-tag）的编码序列融合。crtE基因全长906 bp，编码蛋白（包括His-tag）的分子量约为35 kDa。【器材与试剂】1实验仪器 细菌培养箱，摇床，台式离心机，微量移液器，电泳仪，电泳槽，电炉2实验试剂 蛋白胨，酵母提取物，NaCl，1 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，1 mol/L IPTG(微孔滤膜过滤除菌), 30%凝胶贮液：29%丙烯酰胺，1% N,N-亚甲双丙烯酰胺；10%十二烷基硫酸钠（SDS），N,N, N,N-四甲基乙烯二胺（TEMED），10%过硫酸铵，标准分子量蛋白，蛋白电泳缓冲溶液：25 mmol/L Tris, 250 mmol/L 甘氨酸，0.1% SDS,pH8.3；1.5 mol/L Tris-Cl(pH8.0)，1 mol/L Tris-Cl(pH6.8),蛋白栽样缓冲液（2）：50 mmol/L Tris-Cl(pH6.8)，100 mmol/L 二硫苏糖醇（DTT），2% SDS，10%甘油，0.1%溴酚蓝；染色液：0.2%考马斯亮蓝 R250，40%(v/v)甲醇，10%（v/v）乙酸；脱色液：40%(v/v)甲醇，10%（v/v）乙酸3实验材料 pET-15b，pET-15bcrtE，E.coliBL21(DE3)【实验步骤】1将pET-15b，pET-15bcrtE分别转化E.coliBL21(DE3)，涂布在含100 g/mL 氨苄青霉素钠的LB培养基平板上，37，培养至菌落清楚。2分别挑取转化pET-15b（对照）和pET-15bcrtE的大肠杆菌单菌落，接种于20 mL含100 g/mL 氨苄青霉素钠的LB液体培养基中，37，振荡培养（250 r/min）过夜。3. 取2 mL过夜培养物分别接种到20 mL含100 g/mL氨苄青霉素钠的LB液体培养基中,相同条件下继续培养3 h。4分别加入20 L IPTG溶液，相同条件下，继续培养3 h。5分别取300 L培养物于一Eppendorf管中，10 000 rpm离心1 min，取沉淀。6沉淀用20 L蒸馏水悬浮，加入20 L 蛋白载样缓冲液，混匀，100煮沸5 min。7冷却后，剧烈震荡 剪断DNA，10 000 rpm离心10 min。8分别取对照和工程菌样品20 L用于SDS-PAGE分析，分离胶的浓度为12%。9凝胶用染色液染色12 h，用脱色液脱色至条带清晰。10比较只转化pET-15b的对照菌和工程菌蛋白条带的差异，找出外源基因编码的目的蛋白。【注意事项】1为了获得较高的目的蛋白表达水平，加入IPTG诱导时的工程菌培养物的OD600最好不要超过1。2为了获得比较好的电泳效果，在进行SDS-PAGE分析前应剧烈振荡样品，剪断DNA以降低样品黏度，并离心去除不溶性的细胞裂解物。【实验作业】1 影响外源基因在工程菌中表达量的因素有哪些？2 如何提高工程菌中可溶性目的蛋白的水平？参考文献1. Primrose SB，Twyman RM，Old RW. Principles of gene manipulation (6th ed.). Blackwell Publishing，2001，74752. 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 北京：高等教育出版社，1993. 3813843. 汪靖超，孙东平，杜桂彩等. 噬夏孢欧文氏菌（Erwinia uredovora）类胡萝卜素合成相关基因crtE的克隆及其在大肠杆菌中的表达. 食品科学，2007，28（7）：2762794. Misawa, N., Nakagawa, M., Kobayashi, K., et al. Elucidation of the Envinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli. J Bacreriol，1990, 172: 67046712* pET-15bcrtE可向青岛大学生物系索要，联系方式：实验八亲和层析纯化重组蛋白【实验目的】学习利用镍离子螯合树脂亲和纯化带有多聚组氨酸标签（His-tag）的重组蛋白。【实验原理】利用镍离子螯合树脂特异结合多聚组氨酸的特性，若外源基因编码的目的蛋白在其N-末端或C-末端融合了His-tag，则具有His-tag的重组蛋白可特异结合在镍离子树脂上而将其纯化，经过低浓度咪唑溶液洗涤后，可用高浓度的咪唑溶液将重组蛋白从树脂上洗脱下来，纯化蛋白的纯度可用SDS-PAGE法进行检测。【器材与试剂】1实验仪器 摇床，高速冷冻离心机，超声波细胞破碎仪，微量移液器，电泳仪，蛋白电泳槽2实验试剂 蛋白胨，酵母提取物，NaCl，1 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，1 mol/L IPTG(微孔滤膜过滤除菌), 0.1 mol/L NiCl2，镍离子螯合树脂（His.Bind Resin，美国Novagen公司），结合缓冲溶液：0.5 mol/L NaCl,5 mmol/L咪唑，20 mmol/L Tris-Cl，pH8.0；洗涤缓冲液：0.5 mol/L NaCl,60 mmol/L咪唑，20 mmol/L Tris-Cl，pH8.0；洗脱缓冲液：0.5 mol/L NaCl,0.5 mol/L咪唑，20 mmol/L Tris-Cl，pH8.0；30%凝胶贮液：29% 丙烯酰胺，1% N,N-亚甲双丙烯酰胺；10% 十二烷基硫酸钠（SDS），N,N, N,N-四甲基乙烯二胺（TEMED），10%过硫酸铵，标准分子量蛋白，蛋白电泳缓冲溶液：25 mmol/L Tris, 250 mmol/L 甘氨酸，0.1% SDS,pH8.3；1.5 mol/L Tris-Cl(pH8.0)，1 mol/L Tris-Cl(pH6.8)，蛋白栽样缓冲液（2）：50 mmol/L Tris-Cl(pH6.8)，100 mmol/L 二硫苏糖醇（DTT），2% SDS，10%甘油，0.1%溴酚蓝；染色液：0.2%考马斯亮蓝 R250,40%(v/v)甲醇，10%（v/v）乙酸；脱色液：40%(v/v)甲醇，10%（v/v）乙酸3实验材料 转化了pET-15bcrtE的E.coliBL21(DE3)（工程菌）【实验步骤】1取2 mL左右的树脂装入一小层析柱内，待凝胶沉淀且保护剂流净后，用10 mL蒸馏水冲洗凝胶，然后加入10 mL 0.1 mol/L NiCl2溶液，待其流干净后，用10 mL结合缓冲溶液平衡层析柱。2接种工程菌于20 mL含100 g/mL 氨苄青霉素钠的LB液体培养基中，37，振荡培养（250 r/min）过夜。3将过夜培养物转接到500 mL含100 g/mL 氨苄青霉素钠的LB液体培养基中，37，振荡培养（250 r/min）3 h，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，继续培养4h。4. 培养物在4，5 000g离心10 min，收集菌体。5 菌体重新悬浮于冰冷的20 mL结合缓冲溶液中，冰浴条件下用超声波破碎细胞15次（800W,工作时间10 s，间隔时间60 s）。6细胞裂解液于4，12 000g离心30 min，取上清液，保留50 L以备电泳分析。7将其余上清液加到层析柱内，让其自然流过层析介质。8先用10 mL结合缓冲液冲洗层析柱，再用8 mL洗涤缓冲液洗涤层析柱。9用4 mL洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱液。10分别取10 L细胞裂解液、洗脱液与10 L蛋白载样缓冲液（2）混合，煮沸5 min，SDS-PAGE分析，观察纯化效果。【注意事项】层析过程中所使用的溶液不应含有EDTA、二硫苏糖醇、-巯基乙醇等能敖合金属离子的试剂，以免将树脂上的Ni2+洗掉，导致无法纯化出蛋白。【实验作业】1 除了超声波细胞破碎法以外，常用的细胞破碎还有哪些方法，比较这些方法的优缺点。2 如何有效降低蛋白质纯化过程中发生的降解？参考文献1 User protocol for His.Bind Kits，Novagen，USA.2. 汪靖超，孙东平，杜桂彩等. 噬夏孢欧文氏菌（Erwinia uredovora）类胡萝卜素合成相关基因crtE的克隆及其在大肠杆菌中的表达. 食品科学，2007，28（7）：276279实验九重组蛋白的Dot-Western blot 分析【实验目的】熟悉利用Dot-Western blot进行微量重组蛋白鉴定分析的原理和方法。【实验原理】微量重组蛋白（纯化或未纯化的）固定在硝酸纤维素（NC）膜上以后，用脱脂奶粉封闭NC膜上其他结合位点，利用兔抗重组蛋白的抗体（一抗）可特异与重组蛋白结合的特点，当NC膜与一抗溶液温育时，抗体可特异结合在重组蛋白上，当NC膜再与辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG的抗体（二抗兔）溶液温育时，则该抗体可特异的与一抗结合，将NC膜浸泡在含辣根过氧化物酶底物的溶液中，HRP与二氨基联苯胺（DAB）及H2O2反应生成褐色产物，沉淀于NC膜上重组蛋白所在部位，故可以检测目的蛋白的存在。【器材与试剂】1实验仪器 微量移液器，脱色摇床2实验试剂 封闭液：5%脱脂奶粉，150 mmol/L NaCl， 20 mmol/L Tris-Cl，pH7.5；漂洗液：150 mmol/L，NaCl 20 mmol/L Tris-Cl，pH7.5；显色液：20 mmol/LTris-Cl,pH8.0，0.1% NiCl2 ，0.01% H2O2 ，0.01% 3,3二氨基联苯胺（DAB）3实验材料 1 mg/mL重组牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶，1 mg/mL牛血清白蛋白，兔抗牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶抗血清，羊抗兔IgG的抗体【实验步骤】1分别取重组牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶和牛血清白蛋白（阴性对照）溶液各2 L点在NC膜上的两处，用铅笔标记。2将NC膜放在一个干净培养皿中，加入20 mL封闭液于脱色摇床上温育1 h。3加入10 L兔抗牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶抗血清（按照抗体效价调整一抗加入量），混匀，继续摇动2 h。4弃封闭液， NC膜分别用10 mL漂洗液洗膜3次，每次10 min。5弃漂洗液，重新加入20 mL封闭液和10 L HRP标记的羊抗兔IgG，混匀，于脱色摇床上温育1 h。6弃封闭液，NC膜分别用10 mL漂洗液洗膜3次，每次10 min。7将NC膜转移到一个干净培养皿，加入20 mL显色液