（药剂学专业论文）脂质纳米载体的制备与细胞转运研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 脂质纳米载体的制备与细胞转运研究 中文摘要 脂质纳米载体的制备与细胞转运研究 浙江大学药学院药剂学专业 0 6 级硕士研究生 导师 黄凌斐 袁弘副教授 固体脂质纳米粒 s o l i dl i p i dn a n o p a r t i c l e s s l n 由甘油三酯 复合甘油 酯以及蜡类等天然或合成的脂质材料制备 是继传统的乳剂 脂质体 聚合物 微粒后近年来研究活跃的一种缓控释靶向胶粒给药系统 s l n 具有稳定性高 药物泄漏少 口服生物利用度高 毒性低 能大规模生产等优点 但同时也存 在不少缺点 如有限的载药能力 储藏过程中药物排挤等问题 为改善s l n 的 载药能力和包封率 目前已有一些研究对传统的s l n 制备方法如溶剂扩散法 微乳法 高压乳匀法等方法进行了改进 本研究引入了已在化工及生化产业中广泛应用的 纳米反应器 n a n o r e a c t o r 的概念 对s l n 的制备方法进行了改进 在微小的反应空间中 采用溶剂扩散法制备s l n 以获得包封率和载药量较高的s l n 采用水 t w e e n 8 0 s p a n8 0 正己烷组成的平均粒径为2 7 1n n l 稳定w 0 型微乳体系 可作为 制备s l n 的纳米反应空间 以丙酸倍氯米松 c l o b e t a s o lp r o p i o n a t e 为模型药 物 以单硬脂酸甘油酯 m o n o s t e a r i n 作为脂质材料 考察载药s l n 的理化性 质 并与用传统水性溶剂扩散法制备的s l n 进行比较 新方法中 较小的反应 空间更有利于形成具有小粒径分布 4 0 8n l l l 和2 4 3 9h i 1 的双峰分布 和高载 药能力特性的s l n 在投药量为2 0 时其实际载药量可高达1 5 9 体外释放 试验表明 这种s l n 的释药速率大于传统方法制各的s l n 且药物含量变化对 浙江大学硕士学位论文 脂质纳米载体的制备与细胞转运研究 释药曲线影响不大 目前s l n 的口服给药方式因方便 快捷 患者适应性强 已成为研究热点 但s l n 等微粒系统的吸收转运受胃肠道不同部位的结构特征和生理环境的影响 很大 因此 本研究以能分化出类似于小肠上皮细胞生理特性的c a c o 2 细胞 人 体结肠腺癌细胞 t h eh u m a nc o l o na d e n o c a r c i n o m ac e l ll i n e s 为模型 考察了s l n 给药系统在c a c o 2 单层细胞上的跨膜转运机理 并进一步利用肠道单向灌流的 方法 对载药s l n 的在体吸收进行了研究 研究中采用硬脂胺 异硫氰基荧光素 o c t a d e c y l a m i n e f l u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e o d a f i t c 作为荧光标记物 通过水性溶剂扩散法制备荧光标 记的单硬脂酸甘油酯s l n o d a f i t c 以s l n 作为药物载体后 在c a c o 2 单 层细胞上的表观渗透系数 a p p a r e n tp e r m e a b i l i t yc o e f f i c i e n t p a p p 可从1 3 6 1 0 6c m s 提高至4 7 3 1 0 c m s 吸收量可增加3 5 倍 体现了s l n 在提高药物 转运上的优势 s l n 的细胞转运存在着明显的粒径和浓度依赖性 粒径越小 浓度越低 s l n 的转运能力越强 当s l n 粒径大小在1 0 0n l i l 左右时 p a p p a p t 0b l 可高达2 8 7 1 1 0 6c m s 采用秋水仙素抑制 空白s l n 竞争等条件能够抑 制s l n 在c a c o 2 细胞上的主动转运 实验结果表明 s l n 从肠腔侧 a p i c a l 面 a p 向基底侧 b a s o l a t e r a l 面 b l 进行跨细胞转运时 细胞间隙的被动 转运和细胞吞噬摄取引导的主动转运两种方式共同起作用 在单甘酯中加入液 态油酸 o l e i ca c i d 制备得到的纳米结构脂质载体 n a n o s t r u c t u r e dl i p i dc a r r i e r s n l c 其转运能力显著提高 并且随着油酸含量的增加 纳米粒与细胞间的亲 和力逐渐增强 更利于细胞的融合和转运 n l c 的渗透系数可从4 7 3 1 0 6c m s 增加到7 8 7 1 0 一c r n s 同时 在人体肠道的p e y e r s 集合淋巴小结中 存在着一种特殊的微皱褶或 膜样上皮细胞 简称为m 细胞 m e m b r a n o u s m i c r o f o l dc e l l 其形态结构与 邻近的肠上皮细胞相比 表面微绒毛排列不整齐 已被证明是微粒给药系统在 体内通过p e y e r s 结吸收的重要途径 本研究将培养至1 5 天的c a c o 2 单层细胞 与r a j ib 悬浮细胞共同孵育5 天 可分化出m 细胞 m 细胞的吞饮小泡数量 2 浙江大学硕士学位论文 脂质纳米载体的制备与细胞转运研究 增多 跨膜电阻 t r a n s e p i t h e l i a le l e c t r i c a lr e s i s t a n c e t e e r 降低 因此c a c o 2 单层上分化出m 细胞后 主动吞噬能力和细胞间隙转运途径同时增强 s l n 的转运系数提高到未分化前单层细胞转运的3 倍 p 糖蛋白 p g p p g l y c o p r o t e i n 是一种能量依赖性的 药物溢出泵 d r u g f l u xp u m p 在人体小肠上皮细胞和c a c o 2 细胞模型上均有表达 作为主动转 运的一种方式 p g p 能够将细胞中的药物泵出到细胞外 使胞内药物作用减弱 或丧失 细胞由此获耐药性 因此 本研究也利用c a c o 2 细胞考察了p g p 对 载药s l n 转运的影响 研究以经阿霉素刺激并产生p g p 高表达的c a c o 2 单层 细胞为模型 可以发现阿霉素 d o x o r u b i c i n d o x 紫杉醇 p a c l i t a x e l p t x 1 0 羟基喜树碱 h y d r o x y c a m p t o t h e c i n h c p t 这三种抗癌药在转运时都存在 明显的外排现象 即p a p p b l t o a p p a p p a p t ob l 并且有2 8 倍的差距 表明 细胞内的药物更倾向于被排出到肠腔侧 a p 加入p g p 抑制剂维拉帕米 v e r a p a m i l 之后 各种药物的p a p p b lt oa p 均有所减小 且基本上接近于 p a p p a pt ob l 外排的药物量减少1 4 倍 同时正向吸收转运的量增加1 2 倍 采用s l n 给药后 外排现象减弱更明显 药物从肠腔侧 a p 向基底侧 b l 的正向转运能力可提高1 6 倍 并且s l n 给药系统因能躲避p g p 的识别 其细 胞转运能力与包裹于其中的抗癌药物种类无关 各种载药s l n 的p a p p a l t o a p 均 在8 5 1 0 6c m s 左右 同时 采用单向灌流法模拟胃肠道的生理环境 发现 s l n 作为药物载体在同样有p g p 分布的大鼠小肠上也具有良好的促进吸收作 用 罗丹明和阿霉素的吸收速率都能提高至游离药物的7 5 倍左右 并且s l n 对吸收的促进作用远高于传统的p g p 抑制剂维拉帕米 关键词 固体脂质纳米粒 纳米反应器 硬脂胺 异硫氰基荧光素 c a c o 2 单层细胞 细 胞转运 p 糖蛋白 3 浙江大学硕士学位论文 脂质纳米载体的制各与细胞转运研究 p r e p a r a t i o na n dc e l l u l a rt r a n s p o r to fl i p i d a b s t r a c t n a n o p a r t i c u l a t ec a r r l e r s d e p a r t m e n to fp h a r m a c e u t i c s c o l l e g eo fp h a r m a c e u t i c a ls c i e n c e z h e ji a n gu n i v e r s i t y g r a d u a t es t u d e n t s u p e r v i s o r h u a n gl i n g f e i y u a nh o n g s o l i dl i p i dn a n o p a r t i c l e s s l n i sac o l l o i d a lc a r r i e rf o rc o n t r o l l e dd r u gd e l i v e r y s y s t e mw i t ham e a nd i a m e t e rr a n g i n gf r o m5 0t o10 0 0n l r l i ti sm a d ef r o ms o l i d p h y s i o l o g i c a ll i p i d s m a t e r i a l ss u c ha s h i g h l yp u r i f i e dt r i g l y c e r i d e s c o m p l e x g l y c e r i d em i x t u r e so re v e nw a x e s s l nh a sa d v a n t a g e ss u c ha sg o o dt o l e r a b i l i t y l o w d r u gl e a k i n e s s h i g ho r a lb i o a v a i l a b i l i t y l a r g es c a l ep r o d u c t i o nb yh i g hp r e s s u r e h o m o g e n i z a t i o na n dl e s sa c u t ea n dc h r o n i ct o x i c i t y h o w e v e r t h e r ea r ea l s os o m e p o t e n t i a ll i m i t a t i o n sa s s o c i a t e dw i t hs l n f o re x a m p l e l i m i t e dd r u gl o a d i n gc a p a c i t y d r u ge x p u l s i o nd u r i n gs t o r a g ed u et ot h ec r y s t a l l i z a t i o no fp a r t i c l e s s o m er e f o r m s a n dm o d i f i c a t i o n sb a s e do nt h et r a d i t i o n a lm e t h o d ss u c ha ss o l v e n td i f f u s i o nm e t h o d a n dm i c r o e m u l s i o nm e t h o dw e r ec a r r i e dt oi m p r o v et h ed r u gl o a d i n gc a p a c i t yo f s l n i nt h i ss t u d y t h ec o n c e p to f n a n o r e a c t o r w h i c hh a db e e nw i d e l ya p p l i e di n c h e m i c a le n g i n e e r i n gw a su s e dt op r e p a r es l nt or e s o l v et h ec o n t r a d i c t i o n so ft h e i m p r o v e m e n to fd r u gl o a d i n gc a p a c i t ya n dt h em a i n t e n a n c eo fh ig he n t r a p m e n t e f f i c a c y n a n o r e a c t o rs u c ha sl l a n o e m u l s i o n m i n i e m u l s i o n s u l t r a f i n ee m u l s i o n s s u b m i c r o ne m u l s i o n s i st h em i c r oc i r c u m s t a n c ew h e r et h ec h e m i c a lr e a c t i o n so c c u r 4 浙江大学硕士学位论文 脂质纳米载体的制备与细胞转运研究 n h e x a n e t w e e n8 0a n ds p a n8 0w e r eu s e d 弱t h eo i lp h a s ea n ds u r f a c t a n t c o m b i n a t i o nf o rp r e p a r a t i o no fw om i n i e m u l s i o n r e s p e c t i v e l y a n dt h es i z eo fa s t a b l em i n i e m u l s i o nw a s2 7 1 7 6n l n c l o b e t a s o lp r o p i o n a t ew a su s e d 船am o d e l d r u g a n dm o n o s t e a r i na sal i p i dm a t e r i a l t h ep h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e so ft h e s l nw e r ei n v e s t i g a t e d a n dw a sc o m p a r i n gw i t ht h o s eo fs l np r e p a r e db y c o n v e n t i o n a la q u e o u ss o l v e n td i f f u s i o nm e t h o d t h es l np r e p a r e db yt h en o v e l m e t h o dd i s p l a y e ds m a l l e rp a r t i c l e ss i z ea n dh i g h e rd r u ge n t r a p m e n te f f i c i e n c y a n d 15 9 o fd r u gl o a d i n gw a sa c h i e v e da st h ec h a r g e da m o u n to fd r u gw a s2 0 t h e n v i t r od r u gr e l e a s et e s t si n d i c a t e dt h a tt h ed r u gr e l e a s er a t ew a sf a s t e rt h a nt h a to f s l np r e p a r e db yt h ec o n v e n t i o n a lm e t h o d a n dt h ed r u gc o n t e n ti ns l nd i dn o t a f f e c tt h ei nv i t r od r u gr e l e a s ep r o f i l e n o wo r a ld e l i v e r yo fs l ni sf r e q u e n t l yu s e df o ri t sc o n v e n i e n c ea n dp r a c t i c a l h o w e v e r t h ep h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n sa n dc i r c u m s t a n c eo ft h eg a s t r o i n t e s t i n a lt r a c t c a ns i g n i f i c a n t l ya f f e c tt h eu p t a k ea n dt r a n s p o r to fs l n t h e r e f o r e i ti si m p o r t a n tt o s e a r c hf o rt h ei n f l u e n c e so fg a s t r o i n t e s t i n a lt r a c tc i r c u m s t a n c e so nt h ea b s o r p t i o na n d t r a n s p o r to fs l n c a c o 一2 a ne p i t h e l i a lh u m a nc o l o na d e n o c a r c i n o m ac e l ll i n e w h i c hh a sb e e n w i d e l yu s e dt op r e d i c ti n t e s t i n a la b s o r p t i o no fp o t e n t i a ld r u gc a n d i d a t e s w a sa p p l i e d i no b rr e s e a r c ht os t u d yt h ea b s o r p t i o na n dt r a n s p o r to fs l n a n dt h ea b s o r p t i o n p a t h w a yo fs l nw a sa l s oc l a r i f i e d t h ef l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e f i t c l a b e l e d o t c a d e c y l a m i n e o d a o t c a d e c y l a m i n e f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e o d a f i t c w a ss y n t h e s i z e d a n du s e da saf l u o r e s c e n c em a r k e rt ob ei n c o r p o r a t e di n t os l n b y s o l v e n td i f f u s i o nm e t h o d t h ea p p a r e n tp e r m e a b i l i t yc o e f f i c i e n t p a p p o ff r e eo d a f i t cc o u l di n c r e a s e f r o m1 36 10 6c m st o4 7 3 10 c m sa f t e ri tw a si n c o r p o r a t e di n t os l n w h i c h c a ni m p r o v e dt h ed r u ga b s o r p t i o na b i l i t yo b v i o u s l y t h er e s u l t sa l s os h o w e dt h a tt h e t r a n s p o r to fs l nw a sc o n c e n t r a t i o na n ds i z ed e p e n d e n t p a p pf r o ma p i c a ls i d e a a 浙江大学硕士学位论文 脂质纳米载体的制备与细胞转运研究 t ob a s o l a t e r a ls i d e b l c o u l da sh i g ha s2 8 7 1x10 6c r n s t h ep e r m e a b i l i t yo fs l n i n d i c a t e dt h a tp a s s i v et r a n s p o r tw a st h em a i nr o u t eo fs l na c r o s sf r o mb a s o l a t e r a lt o t h eo t h e rs i d e a n da na c t i v et r a n s f e rw i t hc e l l u l a re n d o c y t o s i sw a sa na d d i t i o n a lw a y f r o ma p i c a lt ob a s o l a t e r a l w h i c hc o u l db ei n h i b i t e db yc o l c h i c i n ea n db l a n ks l n t h em o d i f i c a t i o n so ns l nc o u l da l s oa f f e c tt h eu p t a k ea n dt r a n s p o r to f n a n o p a t i c l e s n a n o s t r u c t u r e dl i p i dc a r r i e r s n l c c o m p o s e do fm o n o s t e a r i ns o l i d l i p i dm a t r i xw i t l lc e r t a i nc o n t e n t so fl i q u i dl i p i ds u c ha so l e i ca c i da n dl e c i t h i nw e r e p r e p a r e d c o m p a r e dt os l n t h et r a n s p o r to fn l c w a si m p r o v e df o r t h eh i g ha f f i n i t y b e t w e e nn a n o p a r t i c l e sa n dt h ec e l l u l a rm e m b r a n e mc e l l s m e m b r a n o u s m i c r o f o l dc e l l w i t hal o w e rt r a n s e p i t h e l i a le l e c t r i c a l r e s i s t a n c e t e e r a n dt h eh i g h e rc e l l u l a re n d o c y t o s i sa b i l i t y w e r eo b t a i n e db y c o c u l t u r eo fc a c o 一2m o n o l a y e ra n dr a jibc e l l s h u m a nb u r k i t t sl y m p h o m ar a jib l i n e t h et r a n s p o r to fs l na c r o s st h e s et w ok i n d so fc e l lm o n o l a y e rw a sc o m p a r e d a n dt h er e s u l ti n d i c a t e dt h a ts l nh a sah i g h e rp a p pi nmc e l l sw h i c hi sa s3f o l d sa s t h a ti nc a c o 2c e l l s p g l y c o p r o t e i n p g p i sa ne n e r g y d e p e n d e n td r u gf l u xp u m p e x i s t e di nb o t h h u m a ne p i t h e l i a la n dc a c o 一2c e l l s t h ed i f f e r e n t i a t e dc a c o 2c e l l sw i t hh i g h e x p r e s s i o no fp g pw e r ea p p l i e dt os t u d yt h ea b i l i t yo fs l n t oi m p r o v ea b s o r p t i o no f d r u g ss u c ha sr h o d a m i n eb d o x o r u b i c i n p a c l i t a x e la n dh y d r o x y c a m p t o t h e c i n w h i c hw o u l db ee f f i u xo u to ft h ec e l l st ot h ea p i c a ls i d eb yp g pp u m p t h ep a p p f r o mb lt oa po ft h e s ef o u rd r u g sw a sm u c hh i g h e rt h a nt h ep a p pf r o ma pt ob l a n dt h ee f f l u xc o u l db ei n h i b i t e db yv e r a p a m i l at r a d i t i o n a lp g pi n h i b i t o r s l n d r u gd e l i v e r ys y s t e mc o u l de n h a n c et h et r a n s p o r ta b i l i t yo ft h e s ed r u g st o1 6f o l d s f o r t h es p e c i a lc e l l u l a re n d o c y t o s i st r a n s p o r ta n du n r e c o g n i z e db yp g p m e a n w h i l e t h ea b s o r p t i o no fs l ni np g pd i s t r i b u t e di nr a t si n t e s t i n a lw a sa l s os t u d i e db yu s i n g s i n g l e p a s s i n t e s t i n a lp e r f u s i o nm e t h o d a n dp e r m e a b i l i t yo fr h o d a m i n ea n d d o x o r u b i c i ni n c r e a s e dt o7 5f o l d sb yi n c o r p o r a t e di n t os l n 6 浙江大学硕士学位论文 脂质纳米载体的制备与细胞转运研究 k e yw o r d s s o l i dl i p i dn a n o p a r t i c l e s n a n o r e a c t o r o c t a d e c y l a m i n e f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e o d a f i t c c a c o 2m o n o l a y e r c e l l u l a rt r a n s p o r t p g l y c o p r o t e i n p g p 7 浙江大学硕士学位论文 脂质纳米载体的制备与细胞转运研究 1 厶 j h 翮青 固体脂质纳米粒 s o l i dl i p i dn a n o p a r t i c l e s s l n 由甘油三酯 复合甘油 酯以及蜡类等天然或合成的脂质材料制备 粒径一般在5 0 1 0 0 0n m 测1 1 与传 统的乳剂 脂质体 聚合物微粒相比 s l n 在室温下通常呈固态 具有聚合物 纳米粒物理稳定性高 药物泄漏少的优势 又兼有脂质体和 u 口服生物利用 度高 毒性低 能大规模生产的优点 其脂质材料骨架可保护药物免受胃肠道 的降解 调节药物的释放曲线 是一种极具潜力的新型给药系统 2 4 但是s l n 也存在不少缺点 5 1 如有限的载药量和包封率 储藏过程中药物 泄漏等问题 据报道 大多数药物的载药量一般为1 5 孵训 只有少量药物 如 用熔融 乳化法制备的泛癸利酮 s l n 6 的载药量可达5 0 同时s l n 主要适用 于包裹亲脂性药物 对于水溶性药物 由于亲脂性的载体与药物之间的性质差 别较大 两者之间的相容性较差 而影响了s l n 对亲水药物的包封 因此如何 解决这些问题是s l n 的主要研究方向 目前许多研究对传统的s l n 制备方法 如溶剂扩散法 高压乳匀法 微乳法 乳化溶剂挥发法 复乳法等方法进行了 改进 7 j 以提高s l n 的载药能力并维持良好的包封率 本研究对固体脂质纳米粒的制备方法进行了改进 采用在 纳米反应器 中溶剂扩散法制备s l n 纳米反应器 已在化工及生化产业中广泛应用 8 1 2 其实质不是一般具体的机械设备 而是反应所处的受纳米尺度调制的一种微观 环境 微乳是纳米反应器的一种 液滴直径在1 0 1 0 0 n m 之间 为各种理化反应 提供纳米尺度的空间 本研究以水 t w e e n8 0 s p a n8 0 正己烷组成w o 型微 乳纳米反应器 考察混合表面活性剂的亲水亲油平衡值 h l b 混合表面活性 剂用量 正己烷 水的比例对w o 型微乳粒径的影响 同时以强效合成糖皮质激 素药物 丙酸倍氯米松为模型药物 以单硬脂酸甘油酯 m o n o s t e a r i n 作为 脂质材料 考察在w o 型微乳中溶剂扩散法制备载药纳米粒的理化性质 如粒 径分布 表面电位 表面形态 药物包封率 载药量及体外释放 并与用传统 水性溶剂扩散法制备的s l n 进行比较 8 浙江大学硕士学位论文 脂质纳米载体的制备与细胞转运研究 在解决s l n 的包封率和载药量较低的问题之后 本研究进一步对s l n 的胃 肠道细胞转运吸收作了考察 目前 s l n 已被证明是多种药物口服吸收的良好 载体 1 3 1 在采用s l n 口服给药时 药物在s l n 中存在的方式 决定了该系统释 药的特征 给药系统在胃肠道不同部位的滞留时间和转运过程以及胃肠道的生 理环境 则对药物吸收效应起关键作用 s l n 等微粒给药系统的吸收主要通过 细胞间隙吸收 细胞吞噬作用 受体介导的内吞和淋巴组织转运等途径 l4 1 在 与胃肠道细胞作用时必须要克服连续两道屏障 粘液层和黏膜层 粒子的理化 性质和成分修饰都会对s l n 的吸收产生影响 因此 对s l n 的胃肠道细胞转运 研究意义重大 c a c o 2 细胞系来源于人体结肠腺癌细胞 t h eh u m a nc o l o na d e n o c a r c i n o m a c e l ll i n e s 1 5 1 8 在一定培养条件下可自发进行上皮样分化并可形成紧密连接 t i g h tj u n c t i o n t j 其形态学 标志酶的功能表达 转运系统的形成以及渗 透特征均与小肠上皮细胞类似 因而作为药物在体小肠吸收的一种有效预测工 具 被广泛应用于药物结构与吸收的关系 药物及制剂对粘膜毒性的评价 肠 腔内p h 值对吸收的影响 药物作用等多方面的研究 c a c o 2 细胞具有三个限制 吸收的因素 即不流动水层 细胞间各种连接处 如紧密连接处 和细胞膜 类似于胃肠道的生理屏障作用 因此 c a c o 2 细胞能在一定程度上反映出s l n 等微粒给药系统的在体肠道吸收情况 有文献报道 1 9 2 0 1 目菊i j c a c o 2 细胞模型 已被用于聚合物纳米粒等微粒给药系统的胃肠道吸收转运研究 本研究对s l n 这种微粒给药系统在c a c o 2 单层细胞上的转运机理进行了 探讨 以硬脂胺 异硫氰基荧光素嫁接物 o c t a d e c y l a m i n e f l u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e o d a f i t c 为标记物 以单硬脂酸甘油酯 m o n o s t e a r i n 为脂 质材料 采用水性溶剂扩散法制备s l n 考察了s l n 的细胞毒性 细胞摄取 以及不同s l n 浓度 不同粒径大小和加入主动转运抑制剂等对s l n 细胞转运的 影响 在s l n 的基础上 在固体脂质单甘酯中加入液态油酸 制备荧光标记的 纳米结构脂质载体 n a n o s t r u c t u r e dl i p i dc a r r i e r s n l c 考察油酸含量不同 对纳米粒细胞转运的影响 同时 在人体肠道的p e y e r s 集合淋巴小结中 存在着一种特殊的微皱褶 9 浙江大学硕士学位论文 脂质纳米载体的制备与细胞转运研究 或膜样上皮细胞 简称为m 细胞 m e m b r a n o u s m i c r o f o l dc e l l 1 9 其形态结 构与邻近的肠上皮细胞相比 表面微绒毛排列不整齐 已被证明是微粒给药系 统在体内通过p e y e r s 结吸收的重要途径 因此 本研究将培养至1 5 天的c a c o 2 单层细胞与r a j ib 悬浮细胞共孵育5 天 在c a c o 2 单层细胞上分化出具有 更强微粒吞噬能力的m 细胞 比较了荧光标记s l n 在m 细胞分化前后的 c a c o 2 单层细胞上转运情况的异同 由于c a c o 2 细胞能表达与多药耐药 m u l t i d r u gr e s i s t a n c e m d r 产生有关 的p 糖蛋白 p g l y c o p r o t e i n p g p 2 1 2 3 1 也常被用于p 糖蛋白与药物处置的研 究 p g p 作为主动转运的一种方式 可能量依赖性地将胞内药物 主要是抗肿 瘤药物 泵出到细胞外 使细胞内药物浓度降低 药物作用减弱或丧失 导致 细胞产生耐药性 据报道 2 4 s l n 因能被肿瘤细胞吞噬摄取而能避开p g p 的作 用 可成功地将抗肿瘤药物运送到靶部位 作为能逆转肿瘤细胞多药耐药现象 的新型缓控释制剂 也是目前的研究热点之一 本研究进一步以p g p 高表达 的c a c o 2 单层细胞为模型 研究了罗丹明b r h o d a m i n eb 阿霉素 d o x o r u b i c i n d o x 紫杉醇 p a c l i t a x e l p t x 1 0 羟基喜树碱 h y d r o x y c a m p t o t h e c i n h c p t 等药物的吸收转运 并采用单甘酯制备载药 s l n 考察s l n 对上述几种药物吸收的影响 同时采用单向灌流法模拟胃肠 道环境 研究负载罗丹明或阿霉素的s l n 在同样有p g p 分布的大鼠小肠上的 吸收情况 l o 浙江大学硕士学位论文 脂质纳米载体的制备与细胞转运研究 第一章纳米反应器中溶剂扩散法制备 固体脂质纳米粒的研究 以w o 型微乳构成纳米反应器 n a n o r e a c t o r 在反应器的水相中通过溶剂 扩散法制备固体脂质纳米粒 s o l i dl i p i dn a n o p a r t i c l e s s l n 以正己烷 z h e x a n e 作为油相 t w e e n8 0 和s p a n8 0 作为混合表面活性剂组成w o 型 微乳 考察了混合表面活性剂的亲水亲油平衡值 h l b 混合表面活性剂用量 正己烷 水的比例对w o 型微乳粒径的影响 同时以丙酸倍氯米松 c l o b e t a s o l p r o p i o n a t e 为模型药物 以单硬脂酸甘油酯 m o n o s t e a r i n 作为脂质材料 考 察在w o 型微乳中溶剂扩散法制备的载药纳米粒的理化性质 如粒径分布 表 面电位 表面形态 药物包封率 载药量及体外释放 并与用传统水性溶剂扩 散法制备的s l n 进行比较 l 材料与仪器 1 1 材料 单硬脂酸甘油酯 m o n o s t e a r i n 上海化学试剂有限公司 丙酸倍氯米松 c l o b e t a s o lp r o p i o n a t e 杭州华东制药有限公司赠送 泊洛沙姆1 8 8 p o l o a x m e r 1 8 8 p o 沈阳药科大学集绮药业有限公司 十二烷基硫酸钠 s o d i u md o d e c y l s u l f a t e s d s 广州市化学试剂玻璃仪器批发部进口分装 聚山梨酯2 0 t w e e n 2 0 聚山梨酯8 0 t w e e n8 0 脂肪酸山梨坦8 0 s p a n8 0 脂肪酸山梨坦8 5 s p a n8 5 正己烷 z h e x a n e 上海化学试剂厂 无水乙醇 杭州长征化工 厂 其余试剂均为分析纯或化学纯 1 2 仪器 3 0 0 0h s 粒度及表面电位分析仪 z e t a s i z e r3 0 0 0h s m a l v e m u k 高速 离心机 3 k 3 0 s i g m a 超声波细胞粉碎机 j y 9 2 i i 宁波新芝科器研究所 高效液相色谱 a g i l e n t1 1 0 0 透析袋 杭州华东制药有限公司 分子量3 5 0 0 浙江大学硕士学位论文 脂质纳米载体的制各与细胞转运研究 电热恒温水槽 d k 8a 上海精宏实验设备有限公司 恒温振荡器 t h z 8 2 上海跃进医疗器械四厂 循环水式多用真空泵 郑州长城仪器厂 恒温磁力 搅拌器 8 5 b 2 南通科学仪器厂 电子天平 f a l l 0 4 上海天平仪器厂 冷 冻干燥机 l a b c o n c o 美国 2 实验方法 2 1w o 型微乳的制备 将s p a n8 0 或s p a n8 5 溶于正己烷制备油相 t w e e n2 0 或t w e e n8 0 溶于水 制备水相 混合后探头超声 工作2s 停l s 4 0 0w 2 0 次 冰浴 形成纳米 反应器分散液 取纳米反应器分散液适量 用正己烷稀释2 0 倍 用3 0 0 0h s 粒 度及表面电位分析仪测定其粒径 2 2 微乳中溶剂扩散法制备s l n 取水1m l s p a n8 02 0 0m g t w e e n8 01 8m g 正己烷1 0 m l 混合 探头超 声形成纳米反应器分散液 取单甘酯 或单甘酯与丙酸倍氯米松混合物 5 0 m g 溶于l m l 乙醇中 加入到l l m l 微乳液中 室温下4 0 0r p m 机械搅拌5 m i n 即得 s l n 的分散体系 2 0 0 0 0r p m 高速离心1 5 m i n 分离得到s l n 沉淀 用2 m l 正 己烷洗涤s l n 沉淀2 次 同样用高速离心分离 沉淀用5 0m l 泊洛沙姆溶液 o 1 w v 分散 得到s l n 分散液 2 3 水性溶剂扩散法制备s l n 取4 5m g 单甘酯与5m g 丙酸倍氯米松溶于5m l 乙醇中 7 1 6 0 溶解 在 4 0 0r p m 机械搅拌条件下注入5 0m l6 0 的水中 继续搅拌5m i n 冷却至室温 用0 1m 的盐酸溶液调节p h 至1 2 使s l n 絮凝 2 0 0 0 0r p m 高速离心1 5 m i n 沉淀用5 0m l 泊洛沙姆溶液 o 1 w v 分散 得到s l n 分散液 2 4s l n 理化性质考察 2 4 1 粒径和表面电位 取s l n 分散液适量 用0 1 泊洛沙姆溶液稀释2 0 倍 用3 0 0 0h s 粒度及 1 2 浙江大学硕士学位论文 脂质纳米载体的制备与细胞转运研究 表面电位分析仪测定其粒径和表面电位 2 4 2 表面结构观察 纳米粒表面形态的表征仪器为s p a3 8 0 0n 型原子力显微镜 a f m 微悬 臂长度为1 8 0h i l l 扫描针尖为商用氮化硅针尖 力常数约为3 2n m 成像模 式为轻敲模式 s l n 分散液用蒸馏水稀释1 0 倍 以滴管移取2 滴于新制的云母 片上 2 5 真空干燥2 4h a f m 观察载药纳米粒的表面结构 2 4 3s l n 的包封率和载药量测定 丙酸倍氯米松含量采用高效液相法 h p l c 检测 7 1 色谱柱 h y p e r s i lc 1 8 柱 1 5 0m m 3 9m m u v 检测波长 2 4 0n l n 柱温 4 0 流动相 甲醇 水 7 4 2 6 v v 流速 0 7m l m i n 一 进样量 2 0 l 制备得到的载药s l n 加5 0m lo 1 5 s d s 涡旋震荡3m i n 洗去表面游离药 物 丙酸倍氯米松在0 1 5 s d s 中的溶解度约为1 3 肛g m 1 絮凝 离心 2 0 0 0 0 r p m 1 5m i n 收集s l n 得到的s l n 加水再分散 脂质浓度1 0 w v 7 5 预冻5h 后 冷冻 干燥7 2h 得粉末 称重 w o 上述粉末用2 5m l 甲醇7 0 c