干旱胁迫对小麦幼苗的影响.doc

干旱胁迫对小麦幼苗生理生化指标的影响杨万坤 114120238 11应用生物教育A班摘要：用小麦幼苗为实验材料，研究干旱胁迫对小麦幼苗生理生化指标的影响。试验结果表明：在干旱胁迫(5天)下小麦幼苗中脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）、抗氧化酶（PPO、POD）、谷胱甘肽(GSH)、ASA的含量都较正常情况下小麦幼苗的含量高。关键字：干旱胁迫、小麦幼苗、Pro、MDA、H2O2、PPO、POD、GSH、ASA引言：小麦是我国北方地区的主要粮食作物，但是近几年北方地区旱情日益严重，小麦产量安全问题日益突出。干旱也属于逆境，水分在植物的生命活动中占主导地位，大多数植物遭受干旱逆境后各个生理过程都会受到不同程度的影响。干旱是我国农业可持续发展面临的主要问题之一, 干旱胁迫对植物的影响是一个复杂的生理生化过程, 涉及到许多生物大分子和小分子【1】。干旱胁迫对植物的影响主要体现在酶活性、膜系统、细胞失水等，导致细胞代谢紊乱，甚至是细胞死亡。本次试验测定正常生长的小麦幼苗和干旱胁迫处理小麦幼苗中脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）、过氧化氢、抗氧化酶（PPO、POD）、谷胱甘肽(GSH)、ASA的含量变化, 来研究干旱胁迫对小麦的影响，从而找到合适的方法来解决干旱胁迫问题，解决小麦生产安全问题提供理论依据。1材料与方法1.1材料及处理将小麦种子用0.1% HgCl2消毒10 min后，用蒸馏水漂洗干净，用蒸馏水于26下吸涨12 h，然后播于垫有6层湿润滤纸的带盖白磁盘（24cm16cm）中 于26下暗萌发60h，计算发芽率（注意与前面结果比较），选取长势一致的小麦幼苗做干旱5天干旱处理。 5天后用相同的方法分别对实验组和对照组的小麦进行脯氨酸、MDA、过氧化氢、抗氧化酶（PPO、POD）、GSH、ASA的含量的测定。1.2测定方法1.21玉米种子发芽率的测定各取50粒吸胀的玉米种子沿胚的中心线切成两半（严格区分两个半粒），进行下列实验：其中50个半粒进行TTC染色（30水浴 20 min），另50个半粒进行曙红染色（室温染色10 min）洗净后观察。 根据两种方法的染色情况，分别计算发芽率。1.22小麦幼苗脯氨酸含量的测定分别取0.1 g实验组和对照组的胚芽鞘加入3 ml 3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂充分研磨用2 ml 3% SSA洗研钵5000 rpm离心10 min 量上清液体积。 测定：上清液各2 ml 分别加入2 ml冰乙酸和2 ml茚三酮试剂煮沸15 min冷却后5000 rpm离心10 min（若没沉淀可省略次步骤） 分别测定A520,将测得的结果用公式Pro content = （umol.g-1FW）计算出正常和干旱生长小麦的胚芽鞘的脯氨酸含量。1.23小麦幼苗MDA含量的测定分别取0.1 g实验组和对照组加入3 ml10TCA (和少许石英砂充分研磨用2 ml10TCA洗研钵5000 rpm离心10 min 量上清液体积。 测定：分别取上清液各2 ml 加入0.6%TBA（用10% TCA配制） 2 ml煮沸15 min冷却后5000 rpm离心10 min 分别测定OD450和OD532将测得的D450和OD532的数据带入下列公式OD450=C1x 85.4 OD532 = C1x 7.4C2X155000求解方程得：C1/(mmol/L)=11.71 OD450C2/(umol/L)=6.45 OD5320.56 OD450计算出C1可溶性糖的浓度，C2为MDA的浓度。1.24 小麦幼苗H2O2测定分别取0.51g实验组和对照组加入3 ml 0.3% TCA和少许石英砂充分研磨用2 ml 0.3% TCA洗研钵5000 rpm离心10 min 量上清液体积。测定：分别取上清液各4ml 加入0.1%Ti(SO4)2 用20%(v/v) H2SO4配制 1 ml摇匀 5000 rpm离心10 min OD410将测得的OD410值带入下列公式H2O2 content = （ umol.g-1FW）计算出H2O2酶的含量。1.25小麦幼苗抗氧化酶的测定1、分别取0.1 g实验材料加入少许石英砂和3 ml提取液（50mmol/L PBS, pH6.0,内含0.1mmol/ LEDTA, 1%PVP） 充分研磨转入离心管中用2 ml提取液洗研钵 5000 rpm离心10 min 量上清液体积用于测定POD和PPO酶活性或分装后转至-20或-80保存。2、POD测定：取POD反应混合液（10mmol/L愈创木酚，5 mmol/L H2O2,用PBS溶解）2.95 ml，加入酶液50 ul（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，每过1 min记录一次在A470的读数值。3、PPO测定：取PPO反应混合液（ 20 mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）2.9ml，加入酶液0.1 ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，每过 30s记录一次在A410的读数值。以每分钟A值变化0.01所需要的酶液的量为一个活力单位（U），则：将测得的A470和A410数据带入公式POD activities=（umol.g-1FW）的PPO activies=(U.g-1FW)计算出PPO和POD的值1.26小麦幼苗GSH的测定分别取0.1 g实验组和对照组的胚芽鞘加入3 ml 5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂充分研磨用2 ml 5% TCA洗研钵 5000 rpm离心10 min 量上清液体积。测定：上清液各1 ml （空白用5% TCA代替） 分别加入2ml0.1M PBS (pH=7.7) 1 ml 2 mM DTNB 25 5 min测定A412将测得的A412值带入公式GSH content= (umol.g-1FW)将GSH的值计算出来1.27小麦幼苗ASA的测定 ASA的提取：分别取0.2 g实验组和对照组的胚芽鞘加入3 ml 5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂充分研磨用2 ml 5% TCA洗研钵 5000 rpm离心10 min 量上清液体积。 测定：上清液各0.8 ml (空白用5% TCA代替) 分别加入0.8 ml 0.15 M NaH2PO4 (pH=7.4) 和蒸馏水 摇匀 分别加入 0.8 ml 5% TCA、44%磷酸和4%联吡啶 摇匀 加入3%FeCl3 0.8 ml 37 15 min 测定A525 ASA content = (umol.g-1FW)2、结果与分析发芽率的测定：TTC染色法：44个具有活力。曙红染色法：44个具有活力。分别计算两种方法的发芽率：TTC法 44 /50100%=88%；曙红染色法 44 / 50100%=88%。用两种方法测得的种子发芽率是一样的，都为88%,说明这一批种子的生命活力较高。脯氨酸含量测定：组别A520V总V显V用Pro content干旱组1.8424.8 ml6ml2ml0.08187mol.g-1FW对照组0.0185.3 ml6ml2ml0.00088 mol.g-1FW计算结果为干旱组脯氨酸含量为0.08187mol.g-1FW，对照组脯氨酸含量为0.00088mol.g-1FW. 实验组与对照组比较，可以看出实验组的脯氨酸含量是对照组的93倍。MDA含量的测定： 数据组别OD532OD450结果C1C2干旱组0.3031.36716.007 mmol/L1.189 mol/L对照组0.0290.0380.445 mmol/L0.166mol/L由上表可知干旱组的MDA的浓度为1.189 mol/L，对照组的MDA的浓度为0.166mol/L，干旱组为对照组的7倍左右，说明当遇到干旱胁迫时小麦幼苗中MDA含量比正常生长的含量高。H2O2测定： 组别 V总V用V显OD410H2O2 content干旱组3. 8ml3.8 ml4ml0.9800.14 mol.g-1FW对照组4.7 ml4 ml4.2ml0.2020.0356mol.g-1FW上述计算结果得到干旱组中H2O2为0.14 umol.g-1FW，对照组中H2O2为0.0356umol.g-1FW，干旱组为对照组的4倍左右，说明当遇到干旱胁迫时小麦幼苗中H2O2含量迅速成倍上升。抗氧化酶的测定V总V用V显POD干旱组4.6ml0.05 ml3ml对照组4.6ml0.05 ml3mlPPO干旱组4.6ml0.1 ml3ml对照组4.6ml0.1 ml3mlPOD在不同时间的A470值： 时间和结果组别 1 min2 min3min4minPOD activities（t=4min）干旱组1.221.611.862.5650.0456umol.g-1FWmin-1对照组1.031.5281.7892.2020.0342umol.g-1FWmin-1PPO在不同时间的A410值：时间和结果组别 0.5min1min1.5min2minPPO activities(t=2min)干旱组0.0410.0820.1180.1473250.7 U.g-1FW对照组0.0420.0820.1090.1322790.7U.g-1FW由上表可知当小麦幼苗遭受干旱胁迫时，抗氧化酶（POD,PPO）含量有明显上升。GSH的测定组别V总V用V显A412GSH content干旱组4.3ml1ml4ml0.2070.0026umol.g-1FW对照组4.3 ml1ml4ml0.0240.00031umol.g-1FW由上述计算结果可知受到干旱胁迫的小麦幼苗的胚芽鞘中GSH含量是正常生长的8倍左右，表明遭受干旱胁迫时小麦幼苗中GSH含量迅速上升。ASA的测定组别V总V显V用WA525ASA content干旱组4.4ml5.6ml0.8ml0.2g0.1060.00098umol.g-1FW对照组5.2ml5.6ml0.8ml0.2g0.0240.00026umol.g-1FW由上述计算结果可知受到干旱胁迫的小麦幼苗中ASA的含量是正常生长的4倍左右，表明遭受干旱胁迫时小麦幼苗中ASA含量迅速上升。3、讨论测定玉米发芽率时所用的两种方法：TTC染色法和曙红染色法测得发芽率均为88%。TTC染色法的染色部位是胚，染色较深，能清晰判别胚的死活，曙红染色法的染色部位是胚乳，着色较浅。实验中玉米用两种方法都发现有部分玉米胚细胞坏死，但主要在子叶部分，少许在胚根处（判断为不能正常发芽生长），这批玉米种子可能因为储存时间过长或其他因素造成影响，影响其发芽率，但总体来说这批种子发芽率很高。本次实验结果中当小麦幼苗遭受干旱胁迫时，脯氨酸含量增高，其中脯氨酸含量是正常生长小麦幼苗的93倍，这一结果与洪法水、李樊和在研究自然干旱胁迫下小麦品种游离脯氨酸与抗旱性的关系所得到的结果基本相似【2】。科学研究发现：脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有很强的水合能力，其水溶液具有很高的水势。脯氨酸的疏水端可与蛋白质结合，亲水端可与水分子结合，蛋白质可借助脯氨酸束缚更多的水，从而防止渗透胁迫条件下蛋白质的脱水变性。因此脯氨酸在植物的渗透调节中起重要作用，而且即使在含水量很低的细胞内，脯氨酸溶液仍能提供足够的自由水，以维持正常的生命活动。正常情况下，植物体内脯氨酸含量并不高，但遭受干旱等胁迫时，脯氨酸含量明显增加。Mattioni研究发现,小麦幼苗在水分胁迫下,氨基酸都有所积累, 但 Pro积累更多。P5C(吡咯啉-5-羧酸还原酶) 和脯氨酸脱氢酶是控制 Pro生物合成和分解的酶。在水分胁迫下, P5C活性增强而脱氢酶活性受抑制, 导致Pro增加【3】。这些说明在遭受干旱胁迫时，小麦幼苗通过增加细胞中的Pro含量来抵御干旱胁迫。实验结果表明干旱胁迫下生长的小麦胚芽鞘内所含的MDA量比正常生长的小麦所含量高（约为7倍）。科学研究表明：植物器官在逆境条件下 , 往往发生膜脂过氧化作用 ,丙二醛 (MDA ) 是其主要产物，具有很强的细胞毒性 ,对膜和细胞中的许多生物功能分子如蛋白质、核酸和酶等均具有很强的破坏作用 。故 MDA含量可以作为鉴定小麦抗旱性能指标之一，含量低时表明小麦的抗氧化能力强，抗旱性也强【4】。MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害，其含量的多少代表膜损害程度，本次实验研究数据说明，干旱使小麦细胞膜系统受到一定的损害。 试验结果表明当小麦幼苗遭受干旱胁迫时，H2O2含量上升（约是对照组的4倍）。过氧化氢酶大量分布于动植物细胞内，属于活性氧清除剂，对H2O2和羟自由基有清除能力，是一种细胞保护酶。大部分研究干旱胁迫对植物幼苗保护酶活性影响已经证明，在干旱胁迫中植物体中的过氧化氢酶活性前期升高，但到后期呈下降趋势。这间接证明干旱会使植物体积累过氧化氢。H2O2 过氧化氢是植物代谢中产生的一种产物，其积累对细胞具有氧化破坏作用，在实验中，可根据其值的变化，来了解组织的破坏程度。因此，过氧化氢的含量也是植物逆境的一项指标。与CK相比,干旱胁迫处理的活性氧超氧阴离子（O2-）和过氧化氢(H2O2)逐渐积累【5】 .说明在干旱胁迫细胞有氧代谢加快，H2O2含量增加显著。由实验结果可知干旱组和对照组的抗氧化酶POD含量无明显增加、PPO活性有着明显增加。PPO和 POD 均为植物内源自由基清除剂, 属于保护酶系统【6】。在逆境中保护酶活性增强或维持较高的水平, 能够清除活性氧自由基使之保持较低的水平, 维持细胞膜的稳定性和完整性。在干旱胁迫下，由于抗氧化酶与ROS的动态平衡被打破，造成抗氧化酶（PPO、POD）的积累。在干旱胁迫下PPO、POD含量上升，POD催化其它底物与H2O2反应以消耗H2O2植物在受水胁迫及时复水，可诱导体内POD 活性上升，从而起到保护植物的作用。POD 活性在干旱胁迫下增强, 能通过增强POD 活性来抵御干旱逆境对其所造成的伤害【7】。多酚氧化酶( polphenol oxidase , PPO ) 是植物体内酚类物质氧化或缩合以及木质素合成的重要酶, 提高PPO 活性可促进植株体内酚类物质和木质素的合成和累积以提高植物抗性【8】。本实验中POD、PPO含量均上升，但增加量不是很明显，可能是由于在测定时测PPO、POD顺序（先拉出测的二者读数，隔半分钟后推进去读二者的读数，使二者读数的时间间隔不同）不同，使二者的读数间隔相差较大，造成二者的读数不同。实验结果表明遭受干旱胁迫时小麦幼苗中GSH含量迅速上升，干旱胁迫的小麦幼苗的胚芽鞘中GSH含量是正常生长的8倍。在植物体内活性氧的清除包括酶系统与非酶系统，而谷胱甘肽（GSH）则是非酶系统中活性氧清除的重要抗氧化剂之一。GSH不仅可以直接清除H2O2，在叶绿体中还可以与抗坏血酸协同作用清除H2O2。对于GSH含量的测定，是一个良好的表示抗氧化胁迫的指标。研究表明在水分胁迫下，GSH 含量能增加至50 倍以上，可提高植物的抗氧化能力【9】。本实验验证在干旱胁迫下小麦幼苗中GSH含量比正常显著升高。实验结果表明在干旱胁迫下小麦幼苗中ASA含量比对照组的小麦幼苗4倍，含量明显上升。在姜晶、张宪政的实验中随着水分亏缺天数的增加，可明显降低超氧阴离子自由基（-）的含量；提高超氧化物歧化酶（）和过氧化物酶（）的活性；降低脂氧合酶（）、酸性磷酯酶和过氧化氢酶活性；降低膜脂过氧化主要产物丙二醛（）的含量，同时使过氧化氢（）的含量有所增加。使膜结构与功能在水分亏缺下得到保护，从而提高了小麦的抗旱性【10】。汪晓峰和张宪政研究了外源对小麦的抗旱生理作用的实验结果表明：在水分胁迫下，可缓解小麦水分下降趋势，提高叶绿素和蛋白质含量，抑制的增加，同时提高保护酶的活性，处理还可降低水分胁迫下外渗电导率，对膜起保护作用【11】。翁明阳的实验中，不同抗旱性品种小麦幼苗叶片的抗坏血酸（ASA）含量变化趋势有相似之处，随着干旱胁迫时期的延长，四个抗旱性不同品种都是先上升，到胁迫第4d有回落后，在胁迫第5、6d继续上升【12】。本次实验结果与之相同，说明在遭受干旱胁迫时，小麦幼苗本身会合成大量ASA来抵御干旱。这次实验表明在干旱胁迫下, 小麦幼苗生长受到一定抑制作用,生理生化指标发生一系列变化, 表现为小麦幼苗胚芽鞘中脯氨酸、丙二醛 (MDA) 、H2O2、GSH、过氧化酶（POD、PPO）、GSA含量在干旱胁迫下含量较正常情况下的明显升高。4、参考文