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蚕丝在组织工程中的应用与研究摘要 组织工程的核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体，材料在组织工程中起到了关键的作用。蚕丝作为天然高分子材料，具备优良的力学性能，同时在生物相容性方面又优于传统的人工合成可降解高分子材料，近年来成为组织工程领域令人关注的一类特殊的生物材料。本文从蚕丝的结构组成、理化性质、生物性能等方面对蚕丝进行介绍，并综述了近年来蚕丝在组织工程材料领域上的应用。关键词 蚕丝；生物材料；组织工程引 言支架材料作为组织工程关键因素，其研究得到了突飞猛进的发展，涵盖了天然生物材料及人工合成高分子材料两大类，天然的比如有壳聚糖、明胶、海藻酸钠等，人工合成的主要为酯类的高聚物，比如聚乳糖等。但是，由于人体组织结构的特殊性，尚难以确定哪几种材料为最佳支架材料。蚕丝被证明具有生物相容性、良好的生物力学性能、特异的降解性，对于力学强度要求较高，同时降解时间又较长的支架的构建，蚕丝无疑提供了一种很好的选择。1 蚕丝的组成结构 研究表明蚕丝中蛋白含量高达98%以上，主要是由丝素蛋白、丝胶蛋白和少量蜡质、色素、碳水化合物、无机物组成1。丝素又称丝心，是蚕丝的主体部分，主要由重链(H)、轻链(L)和糖蛋白(P25)组成2，其氨基酸组成结构简单，其中侧基为简单的甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸约占总数的85%，三者摩尔比为431，并且按一定的序列结构排列成较为规则的链段。这些链段的大多位于丝素蛋白的结晶区域，而带有较大侧基的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等主要存在于非结晶区域3。丝素蛋白的构象主要是无规则线团为主，还有少量-转角、-螺旋等。被覆于丝素外围的丝胶层，主要成分为球丝蛋白（通常称为丝胶），由18种氨基酸组成，其中丝氨酸、天门冬氨酸、氨酸含量较高4。2 蚕丝的性能2.1 蚕丝的生物相容性 生物相容性是指材料与人体之间相互作用产生各种复杂的生物、物理及化学反应。与人体接触的生物材料必须无毒、无致敏性，对组织、血液和免疫等系统不产生不良反应。生物相容性是医用生物材料首先要考虑的重要因素。研究结果表明5，粗丝是型免疫反应的潜在免疫原, 从粗丝抽提出来的丝胶引起 T 细胞调节的免疫反应。蚕丝作为缝合线，在加工过程中为加强机械特性能常要加一层蜡或硅胶树脂，而且丝胶的抽提程度、蜡的化学性质以及加工过程中许多因素都会影响对丝蛋白纤维生物反应的评价。丝胶类糖蛋白是不利于生物相容的, 是致超敏反应的主要因素，如能将丝胶去除，丝心蛋白对机体的生物应答可与其它普遍应用的生物相容性材料相当。去除丝胶的纤维不会引起T细胞调节的体内应答，可以支持细胞的黏附、分化和组织的体外形成6。有报道将蚕丝心蛋白应用于不同的细胞培养，如成纤维细胞、成骨细胞、人表皮纤维细胞、人表皮角质化细胞、人的骨髓干细胞以及巨细胞等都表现出良好生物相容性。2.2 蚕丝的生物力学性能蚕丝是一种具有优异力学性能的天然有机高分子材料，既具有较高的强度，又有较强的韧性。有研究认为蚕丝的力学性能可能与其二级结构有一定的关系。蚕丝蛋白有4种二级结构，在4种构象中-片层的含量最高，这种高含量的-片层结构，可能是引起其高强度和高弹性模量的主要原因7。同时较高的-螺旋结构含量也会引起较高的强度和弹性模量。因为蚕丝在生物力学性能方面与生物肌腱的相近，以及丝素具有的生物相容性，所以以丝素为开发素材研制生物肌腱有着广阔的前景8。2.3 蚕丝的降解性质 在大多数情况下9，具有生物相容性且可降解的材料对宿主细胞是很有利的，但是降解速率必须与组织的生长发育相匹配，或不能迟于组织的发育，这种平衡可保证在宿主和移植物整合期间具有合适的机械和生物相容性。当两者不相匹配时，就会导致组织提前成熟而失败。蚕丝纤维通过一种缓慢的降解，为细胞培养基质和新组织的形成提供足够的时间和机械支持。蚕丝的降解速度比较缓慢，这个可能与微观-片层晶体结构有关。因此，与其它可降解的合成材料相比，丝蛋白纤维显示出其优越性。由于蛋白酶降解的作用，蚕丝纤维在体内1年就失去大部分张力, 2年后就不会被机体识别。同时蚕丝的降解速率还受移植部位、动物模型、机械环境的影响, 也与患者的健康和生理状态有关10。Lam et al11认为丝素是可生物降解的，这是因为丝素对蛋白水解酶敏感。将干法纺成的热拉伸聚-乳酸（PLLA）纤维与鼠腹部周围肌肉层内几种可吸收的和不可降解的缝合线做比较，体内2周后，通过扫描电子显微镜观察到 PLLA、PDS、Vicryl 和黑辫状丝有降解迹象出现。2周后除了单纤维尼龙外,所有缝合线都诱发慢性炎症反应。体内6周和12周后，丝已经成碎屑。第24周，体内没有观察到丝和炎症，很有可能是通过蛋白水解酶的消化作用使丝快速降解了。由于 Vicryl 的存在，到第6周体内炎症开始减退。体内第80周（这个实验的最终时间）PLLA 周围出现了慢性炎症反应。这进一步表明丝蛋白纤维是可降解的。3 蚕丝在组织工程上的应用 3.1 作为细胞培养基质 建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体是组织工程的关键。三维空间结构为细胞提供了获取营养、气体交换、排泄废物和生长代谢的场所，也是形成新的具有形态和功能的组织、器官的物质基础12。蚕丝是天然成品，丝素蛋白整体上带负电，带负电的生物材料生体相容性较好。研究表明，蚕丝水解蛋白非结晶区有许多碱性氨基酸，与胶原蛋白一样，对体外培养的动物细胞有良好的吸附作用，对维持细胞功能也有重要作用。从不同角度进行的检测结果表明：丝素蛋白无毒性、无刺激作用、无过敏性，具有良好的生物相容性和表面活性，是细胞立体培养的天然支架，其来源丰富，价格便宜，处理简单13。3.2 蚕丝在骨组织工程材料上的应用 骨组织工程需要生物材料支架作为种植细胞的黏附基质，同时支架也为新的骨相关细胞外基质的形成提供物理支持，因此这种支架材料不仅要有良好的生物相容性而且要有合适的降解性能以及良好力学性能，而用于骨移植的材料主要受到力学性能阻碍14。由于丝素具有良好的力学性能和缓慢的降解性能可以为骨重构提供足够的时间，所以近年来在骨组织工程上受到青睐。Lorenz Meinelden15将蚕丝通过一定的处理脱去丝胶制成支架，将这种支架作为骨组织工程中干细胞在骨原性的条件下培养的模板，在生物反应器内培养5周左右，然后将这种复合骨组织工程移植物移植到大鼠颅盖骨临界大小的缺损处，结果发现这种复合体系能诱导和加速骨形成。后来又将这种体系作为裸鼠临界大小缺损的股骨修复移植物，也成功地愈合了股骨的缺损。这些结果表明这种缓慢降解的蛋白基质有足够的时间控制羟磷石灰的沉积，最终导致骨骼的形成，同时也说明蚕丝这种天然的生物材料具有良好的生物相容性、缓慢的生物降解速率以及合适的力学性能，是一种很有潜力的骨组织工程材料。Li C 等16将丝心蛋白与骨形态发生蛋白-2、羟磷灰石微粒通过电旋转搅拌混合制备成三维支架，将这个支架用于体外骨形成。结果发现，这种支架能提高钙盐沉积量和增加了骨特异性标记物的转录水平，从而表明这种支架能有效地释放BMP-2并且有助于磷灰石盐的形成。此研究结构进一步表明，以丝素蛋白为基础的支架是骨组织工程的一种很有潜力的侯选材料之一。3.3 蚕丝在人工血管上的应用 利用丝素具有的抗凝血性能可以开发人工血管。将丝素涂覆在聚酯纤维的表面,然后将这种材料注入活犬的大腿静脉中进行活体试验,结果对血栓的形成有抑制作用17。如将丝素溶液干燥成膜时，把具有抗血凝固性能的药品加入其中，就可制造人造血管，这一研究已取得突破性进展。将蚕丝用浓硫酸处理后，使蚕丝分子中含有大量的硫酸基,形成具有抗血液凝固活性的化合物。一般血液抽出后5min就会凝固，而添加了蚕丝化合物后,即使经过2h以上亦不产生凝固反应。若使用氯化硫酸代替浓硫酸18，得到的抗血液凝固活性提高约100倍。这种物质造价低,可作为抗凝血的试用药，亦可用来提高人造血管的生物机能。除此之外，还可以对丝素蛋白进行表面磺酸化。采用二氧化硫等离子体处理在丝素蛋白膜引入磺酸基团；或丝素蛋白膜用氨气等离子体处理后利用 1,3-二丙磺酸内脂与氨基的反应在材料表面接枝磺酸基团。两种方法均能在丝素蛋白膜表面有效地接枝磺酸基团，而且材料的抗凝血性能有显著提高19。而且这些材料都可以低价制造，从而使丝素蛋白在人造血管的制造与应用方面具有较好的前景。3.4 蚕丝在人工肌腱和韧带的应用 蚕丝的强度和弹性系数与生物体的肌腱有近似数值20，高分子量丝素粉末加热或加压后易成型,添加 40%甲基丙烯酸缩水甘油酯或甲基丙烯酸甲酯后,其强度与聚丙烯相仿。日本蚕丝昆虫研究所的研究人员用丙烯酸处理蚕丝,使其分子结构发生改变后能很容易地吸收钙。研究发现种植在丝素和 RGD修饰的丝素蛋白基质上的肌腱细胞有黏附、增殖、分化功能，从而表明丝素蛋白和 RGD修饰的丝素蛋白在肌腱重建和肌腱愈合等方面有广泛的应用价值。 丝蛋白纤维上引入磷酸基团时，能够吸收钙离子,从而可用于制造人工肌腱。因为其能够吸附在羟基磷灰石(骨头的主要成分)上形成很强的结晶，钙的凝集量比未处理的丝素蛋白有大幅度的增加，而且这些经过修饰的丝纤维有良好的拉伸性能。研究表明，蚕丝纤维具有良好的力学性质，生物相容性以及缓慢的降解速率，是制作人工韧带和人工肌腱的良好支架材料。3.5 蚕丝在人工皮肤应用丝素蛋白质的氨基酸组成以甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸为主，与人体的皮肤和头发的角朊极为相似，因此可以将丝素用于人造皮肤的制作。目前应用丝素膜作为暂时性皮肤替代物已经被应用于烧伤的临床治疗上21。丝素膜经60Co辐照消毒可制成创面保护膜用于浅度烧伤，创伤和整形取皮区等皮肤缺损创面的治疗。其透明性使观察创面情况较为容易，创面的痛感较弱，膜与创口贴合紧密，但又不易融化，可以防止感染，同时又保持良好的透气性，再加上丝素本身对皮肤细胞的生长促进功能，使其愈创效果更显突出22。Roh DH23等将丝素蛋白和海藻酸盐混合制备成复合海绵用于大鼠皮肤深度损伤修复，结果发现丝素蛋白/海藻酸盐复合体的半数愈合时间明显少于丝素纤维膜、海藻酸盐以及普通的纱布，还有丝素蛋白/海藻酸盐明显增加了重新形成的上皮面积和增殖性细胞核抗原阳性细胞的数量，这些结果表明丝素蛋白/海藻酸盐复合物的创伤愈合作用相对单纯的丝素蛋白和海藻酸盐是最好的。4 蚕丝的近期研究4.1 蚕丝与干细胞的合作和现有的人工合成材料比起来，以蚕丝为原料的生物材料更容易被人体所吸收，而且一旦运用到临床上，可以帮患者大大降低医疗费用。纸尿裤是宝宝的专用产品，但是现在许多中老年妇女也会使用纸尿裤。目前在医学领域中使用比较广泛的一个方法，就是植入一条人工吊带，将尿道加以悬吊达到控尿的目的，这条人工合成的吊带，目前普遍使用聚丙烯做材料。这种人工合成的吊带，是不能被人体吸收的，而且终身不能降解。因此，有少部分的患者无法和人工吊带达成和解。正是为了解决这种材料的局限性，研究以蚕丝为原材料，将蚕丝编织成网状结构，同时将干细胞体外培养扩增后放在蚕丝网片上，卷起来成一带状组织。通过手术，就能将这条带状组织植入人体，帮助患者治疗尿失禁。4.2 利用蚕丝研制出新材料 先将蚕茧煮沸，然后从中提取蛋白质用于生产某些新的物质，新物质在医药以及其他许多领域都将有广泛的应用。将一个蜡模侵入蚕丝溶液中会形成一种丝管，这种丝管可用作血管移植、神经导管等。利用蚕丝还可以制造蚕丝全息图、超材料、RFID线圈、脱胶丝、纯净蚕丝蛋白粉、超材料天线、蚕丝凝胶体、丝支架、丝质艺术品等。总 结组织工程学开始于20世纪70年代后期，目前已发展到高级组织工程学的阶段了。支架材料作为组织工程的关键因素，蚕丝是一种资源丰富性能优良的生物材料，本身包含很多生物信息，具有良好的生物相容性，力学性能。近年来，随着组织工程学迅速发展，蚕丝在组织工程材料上的应用也日益增多， 蚕丝作为血管构建，人造皮肤，韧带修复，软骨细胞立体培养以及手术缝合线等材料已经得到初步的应用，但是其稳定性能还有待进一步研究和优化。还有作为神经支架对神经进行修复的报道还较少，若将这一材料通过一定的改造，制成三维支架用于神经修复，有望给神经缺损的病人带来福音。目前蚕丝的组织工程支架的应用离工程化上有一定的距离，今后还要对蚕丝的物理、化学、生物学性能进一步研究，对组织生长因子和蚕丝组织工程支架材料的复合进一步研究，使其适应不同病损组织的要求，提高组织的修复能力， 以推动组织工程的发展。参考文献1 颜文龙，孙恩杰。一种新型的组织工程支架材料蚕丝J.化学与生物工程,2004,(2): 43-47. 2 Tanaka K,Kajiyama N,Ishikura K,et al. 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