ATP结合盒转运蛋白与MDR逆转剂.docx

ATP结合盒转运蛋白与MDR逆转剂发表者：姜超248人已访问目前恶性肿瘤严重威胁人类的健康和生命，是人类死亡的主要病因之一，其发病率逐年上升。肿瘤的治疗临床上是以手术或者放化疗为主，结合生物免疫以及中医药治疗为辅的综合治疗。其中化疗是绝大多数肿瘤病人都需要使用的重要治疗措施。少数肿瘤可以通过化疗达到临床治愈，然而对于大多数肿瘤化疗药物无法根本上铲除肿瘤。化疗失败的主要原因之一就是肿瘤耐药。肿瘤耐药可以分为原发耐药和获得性耐药，分别指肿瘤细胞在未接触化疗药时就已经具有的耐药性和在化疗过程中逐步产生的耐药性。肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时，对结构和作用机制完全不同的抗肿瘤药物往往也产生交叉耐药，这种现象被成为肿瘤的多药耐药(multidrug resistance，MDR)，是放化疗失败和肿瘤复发的关键原因。ATP结合盒（ATP-binding cassette,ABC）转运蛋白家族介导的药物外排泵机制是肿瘤耐药的重要发生机制1。根据序列同源性与结构域组成，ABC家族基因可分为ABCABCG等个7亚家族2，分别编码不同跨膜蛋白。它们的共同特点是在跨膜区组成通道, 胞浆内面存在ATP 结合区，在Mg2+的参与下水解ATP，完成磷酸化，调节跨膜蛋白离子通道活性3，因而能够转运多种疏水性分子。当这些结构不同的底物进入细胞的浆膜后，ATP转运蛋白可以识别并与之结合，引起ATP结合区的活化，从而水解ATP，跨膜通道的构象发生改变，将底物泵出到细胞外。随后，再次发生ATP分子水解，使转运蛋白恢复到原来的构象。这样转运蛋白则以ATP能量依赖的方式主动地将疏水性的底物从细胞内泵出到细胞外。如果将进入细胞的抗肿瘤药再重新泵出到细胞外，就会降低细胞内药物蓄积, 从而起到降低抗肿瘤药疗效产生耐药作用。研究表明，ABC转运蛋白不仅在肿瘤细胞中高表达, 在许多正常组织细胞中也高表达, 具有一定的生理功能。脑、肝脏、小肠、大肠、胰腺、肾脏、睾丸及肾上腺等的上皮细胞及某些内皮细胞均被发现有ABC转运蛋白的表达4。ABC转运蛋白具有以下生理功能：将外源性毒素分泌到胆管、肠管、泌尿系统内, 促进排泄，减少吸收；跨膜转运甾体类激素有利于发挥其正常作用；维持血脑、血胎盘及血睾屏障功能，防止大脑、睾丸、胎儿受到不良影响；保护和调节干细胞的功能；维持某些口服类药物如地高辛等的生物利用度（这些药物往往是ABC药泵的底物）5。，ATP转运蛋白家族中P-糖蛋白( P-glycoprotein, P-gp,) 、多药耐药相关蛋白( multidrug resistance-associated protein, MRP) 以及乳腺癌耐药蛋白( breast cancerresistance protein, BCRP)与MDR的关系最为密切，也是MDR逆转研究的热点。1 P-gp人类P-gp 是1个磷酸化和糖基化的跨膜外向转运蛋白，由ABCB1(MDRI)基因编码, 位于人类染色体7q21.1, 由1280个氨基酸组成, 分子量为170000, 包含2个同源单体,每个单体又含有6个疏水跨膜部分和1个胞内ATP结合部位组成和高度保守的“Walker A”和“Walker B”结构。多种化疗药物包括蒽环类、长春碱类、紫杉烷类、鬼臼乙叉甙类及米托蒽醌、丝裂霉素等都是它的底物。肿瘤细胞上高表达的P-gp可以降低抗肿瘤药物在细胞内的累积，从而导致临床耐药的发生。研究证实几乎所有类型的肿瘤，包括肉瘤、白血病、淋巴瘤等在内，均有MDR1基因的表达。根据MDR1基因在人体肿瘤中表达的水平，Nooter6将肿瘤分为三类：（1）MDR1基因高度表达的肿瘤，如肾癌、胰腺癌、肝细胞癌等。这类肿瘤的来源组织本身就有中等或高度的MDR1基因的表达，多表现为原发性耐药，化疗效果差；（2）MDR1基因中度表达的肿瘤，如乳腺癌、神经母细胞瘤、白血病等。这类肿瘤较敏感，但是大部分病人在化疗结束后都有复发，复发后MDR1基因表达的水平更高，对原来敏感的化疗药物耐药；（3）MDR1基因低度表达的肿瘤，如卵巢癌、小细胞肺癌等。虽然这类肿瘤对化疗药物敏感，但是也会产生多药耐药。Burger等7用实时定量RT-PCR方法分析了59例原发乳腺癌标本，结果表明P-gp的表达水平与化疗药物的初次治疗效果呈负相关，而且P-gp高表达的肿瘤往往预后较差。P-gp已经成为一个重要的肿瘤靶点，通过抑制P-gp功能或表达从而逆转肿瘤细胞的多药耐药性，使肿瘤细胞恢复对化疗药物的敏感性具有非常重要的临床研究和应用价值。P-gp抑制剂（MDR逆转剂、肿瘤化疗增敏剂）8近来成为研究的热点，根据P-gp抑制剂出现的先后顺序和作用特点将其分为三代：第一代抑制剂的研究开始于1981年。有学者发现钙离子通道阻滞剂维拉帕米能够通过直接与部分抗肿瘤药物竞争P-gp药泵的外排作用，而提高肿瘤细胞内化疗药物的浓度，从而达到逆转MDR的作用。后来发现其他的钙通道阻滞剂也有类似作用。第一代P-gp抑制剂还包括：钙调蛋白拮抗剂，环孢菌素，喹啉及甾体激素类等，其中环抱素的作用最强。它们的主要特点是在体外试验中可以逆转甚至完全逆转MDR。但在体内试验中，由于自身的剂量限制性毒性，体内不能达到有效逆转MDR所需要的浓度，例如体内运用维拉帕米出现的严重心血管副作用和环孢菌素强烈的免疫抑制毒性等。第1代逆转剂在未达到抑制转运蛋白的低浓度就会出现严重的人体副作用, 从而失去临床应用价值。第二代抑制剂是通过改造第一代抑制剂的结构，筛选出逆转活性高而自身毒副作用低的化合物，代表化合物有PSC833和VX-710（环抱素D的类似物）还有dexverapamil、dexniguldipine等。由于很多化疗药物既是P - gp 的底物，也是细胞色素P450的同工酶3A4的底物，增敏剂对P450 3A4的竞争结合影响化疗药物的代谢，导致化疗药物血药浓度升高，产生毒副作用。例如PSC833比环抱素逆转的作用强1020倍，且在动物模型中与抗肿瘤药物联合应用时，可使肿瘤体积明显缩小，并有效延长荷瘤动物的寿命9。但在临床试验中发现，PSC833能够通过抑制细胞色素氧化酶P450-3A4介导的紫杉醇和长春新碱代谢，使患者血浆内细胞毒药物水平明显升高而产生毒副作用10。VX-710是一种能够同时抑制P-gp和MRP活性的逆转剂11，逆转活性很高，约为第一代抑制剂的100倍以上。然而, VX-710在与紫杉醇联合用药时能显著降低肿瘤患者的紫杉醇清除率导致毒副反应出现。第三代P-gp抑制剂药物的特点是克服了第二代的缺陷，在与抗肿瘤药物合用时，不影响它们的药代动力学。主要包括：GF120918、LY335979、Lanquidar（R101933）、ONT2093（OC1442093）以及XR9576等。目前已进人临床试验的代表性化合物有LY335979和XR9576等。属于一种二苯基幽烷类衍生物，是一种P-gp高度特异性的抑制剂，但其并非P-gp的底物，对MRP及BCRP无影响，也是迄今发现的最强的P-gp逆转剂之一，XR9576是邻氨苯甲酸的新型衍生物，是一种逆转作用极强、P-gp高度选择性的抑制剂。体内实验表明, XR9576能够显著增强阿霉素、长春新碱及紫杉醇等对人体MDR肿瘤模型的治疗作用，而且不影响这些药物的药物代谢。期临床试验也证实其对部分多药耐药肿瘤有良好的逆转作用12。试验表明LY335979能够明显减小荷瘤小鼠的肿瘤体积，并提高实验动物的生存率，更为重要的是LY335979不影响细胞毒药物的代谢动力学，具有一定开发应用前景13。2MRPMRP亚家族主要有9个成员:MRP1MRP7、ABCC11和ABCC12，基本结构与P-gp类似，其中一个由5个螺旋组成的N末端区域，而MRP4、MRP5则没有此结构。所有的MRP糖基化位点在第2部分的第1个跨膜域外部及末端的延长结构上。Colo等1992年从小细胞肺癌H69 /AR 耐药细胞系中克隆出耐药相关基因MRP属于MRPC家族。与P- gp不同，MRP主要转运疏水性不带电荷的分子或水溶性的阴离子化合物。许多已经证实能够逆转P - gp 介导的药物对由MRP介导的MDR无效。在肝癌细胞中研究发现14，MRP1 表达水平和肿瘤的分化、类型以及微血管侵入相关,MRP1 显著上调则肝癌预后明显较差。在对162 名手术切除肝癌患者的研究后，有学者发现MRP1-1666GG 基因型高表达与肝癌患者低存活率相关15。VOREM等16转染肝癌细胞株HepG2 反义cMOAT cDNA 使MRP2 基因的转录被抑制， 发现转染人细胞的NA 的浓度高低与MRP2 活性成反比，而相应的一些化疗药物的半数抑制浓度在cMOAT cDNA 组也降证明对MRP2 基因的转录抑制后，可增强肝癌细胞的化疗敏感性，并逆转其多药耐药；目前，研究发现主要有以下药物可能逆转由MRP介导的MDR，包括维拉帕米及其衍生物、环孢素A、黄酮类、抗激素类、喹啉类。GST 酶抑制药、非甾体抗炎药如阿司匹林、吲哚美辛、异唑; 唑啉衍生物、地高辛等。维拉帕米可以通过竞争性的与膜上的耐药蛋白（P- gp、MRP1） 结合，达到逆转MRP 多药耐药，通过抑制耐药基因（P- gp、MRP1） 的表达增加化疗药物的敏感性17；Connor等在研究过度表达MRP1的NC IH460细胞时，又发现苏灵大( su-lindac)具有逆转MRP1介导的对ADR 的耐药18 。以上药物能够进入细胞内抑制MRP，但是这些抑制剂与MRP亲和力低且缺乏特异性，可能是因为MRP主要转运阴离子化合物,而阴离子化合物如PAK -104P、非甾体抗炎药物和ONO1078 等很少进入细胞内,所以抑制剂在细胞内很难达到有效抑制浓度。3BCRPBCRP是最近发现的一个ABC药物外排转运蛋白，其为分子量为95000的磷酸化蛋白，与其他的ABC转运蛋白相比较，在结构上属于半转运蛋白，仅有6个螺旋和1个ATP结合位点，多在细胞膜上以同源二聚体的形式发挥作用。目前认为BCRP 定位于细胞膜, 这表明它可能主要参与膜内、膜外药物转运, 而不是改变药物在胞内的分布。BCRP在正常组织中的分布较广泛, 主要分布于具有分布、排泄功能的组织, 尤其在胎盘组织中含量特别丰富。Fumitremorgin C( FTC)和GF120918是最早发现的BCRP 增敏剂，Rabindran19等发现了FTC可降低肿瘤细胞耐药性，增加细胞内的药物聚集，可以有效逆转米托蒽醌，阿霉素，topotecan耐药。而且对P -gp或MRP1介导的耐药性影响小，已经成为BCRP的药理学研究的有用工具，但因为神经毒性不能用于动物和人体。目前已经合成多种毒性低、活性强的FTC 类似物如Ko143，有望成为临床运用 20。Yasuo Imai等认为，植物性雌激素( phytoestro2gens)可以逆转BCBP介导的MDR，研究中发现，植物性雌激素/黄酮类化合物可增强SN - 38和米托蒽醌对BCRP转导的K562细胞的细胞毒性。糖基化的黄酮类化合物对P - gp 介导的长春新碱抗药性和MRP1 介导的VP - 16的抗药性均无影响，然而二者可以增加拓扑替康在K562 /BCRP细胞的积聚 21 。研究者认为，黄酮类化合物和糖基化黄酮类化合物可能会成为克服由BCRP介导的肿瘤细胞多药耐药的有效药物，如果将黄酮类化合物与BCRP底物的抗肿瘤药物联用，可能会改变药物动力学,从而提高特异抗肿瘤药物对肿瘤细胞的细胞毒性。Ahmed - Belkacem等 22 在研究中发现， 6 - Prenylchrysin和Tectochrysin是BCRP的特异抑制剂。与GF120918相比,这两种化合物对P- gp和MRP均无影响，表现出更低的细胞内毒性，且不改变ATP酶活性。Nakamura等 23 发现Gefitinib可以直接逆转BCRP介导的MDR。研究中,发现10mol Gefitinib可以逆转肿瘤细胞对拓朴替康、SN - 38和米托蒽醌的抗药性，提高拓朴替康在耐药细胞内的蓄积。Gefitinib直接抑制拓朴替康转运到囊泡。双嘧哒莫 24 被发现是一种新的BCRP的底物，同时一些钙离子阻滞剂如尼卡地平、尼群地平和尼莫地平可有效抑制米托蒽醌在BCRP过度表达的HEK ( human embryo kidney,人胚胎肾)细胞的外排现象，而同为钙离子阻滞剂的地尔硫艹卓和维拉帕米无此效果。近年来中药逆转肿瘤耐药的研究也得到了广泛的开展。对于中药的活性成分对药物代谢酶和转运体影响的研究很多，并且发现其中一些植物多酚、黄酮、萜类等对P-gp都有一定的抑制作用25-27。有研究证实五味子醇甲A能够增强VCR对耐药肝癌细胞HepG2/ADR 的细胞毒作用，其机制是通过影响P-gp 底物复合物的形成及功能而实现逆转P-gp 介导的多药耐药28。白花蛇舌草提取物对多药耐药白血病细胞HL260/ADR 的生长也具有极强的抑制作用，诱导MDR 其凋亡是其主要机制29。在K562/ADM 裸鼠移植瘤多药耐药模型中，张姚庆华等30发现复方藤梨根制剂可以增加肿瘤细胞内ADM蓄积浓度，实现部分逆转移植瘤的多药耐药性，其机制之一是通过抑制P-gp增加的而实现的。中药复方的研究也在同时进行，有研究发现由黄芪、白术、北沙参等组成的益气养阴方能显著提高顺铂对耐药细胞株A549/DDP 的增殖抑制作用，具有协同增效的作用，逆转A549/DDP 细胞的凋亡抵抗可能是其逆转MDR 的作用机制之一31。中药在逆转肿瘤耐药的同时，往往还具有抗肿瘤、调节免疫等功能，有利于提高肿瘤的整体治疗水平，这是一个颇具临床应用前景的新的研究领域。为临床抗肿瘤药物的研发以及抗肿瘤治疗新方法的发现带来了新的希望。从G418筛选，转染到单克隆化的总结筛选之前确定G418浓度：1.由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。2.G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码3磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。在进行转染时细胞膜受影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。3.汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4.G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在1014天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆加药时间和维持浓度1.由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每35天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200ug/ml。2.加抗生素的时机，主要是考虑插入到细