实验一：淀粉酶产生菌的筛选及酶活力测定.doc

实验一：淀粉酶产生菌的筛选及酶活力测定指导老师：辛XX生命科学学院XX级生物技术班 XX同组人：XX,XX,XX,XX摘要：目的：从以分离到的细菌、放线菌和真菌中筛选出能产生生理活性物质的菌株并测出淀粉酶活力。方法：利用土壤制成菌液，将其涂抹在牛肉膏蛋白胨培养基上进行纯化，再用淀粉培养基培养，最后通过淀粉透明圈的大小来判断淀粉产生菌产淀粉的能力。再使用分光光度计精确测量淀粉酶的酶活力。关键词：淀粉酶；透明圈；酶活力；分光光度计我们从学校的花坛中采集一些土壤样本，拿到实验室中，进行淀粉产生菌的筛选。土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养，几天后在拼板上课长出细菌或者是其他的微生物，并繁殖形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称，它能将淀粉水解成糊精等小分子物质并进一步水解成麦芽糖或葡萄糖，淀粉遇到碘变蓝，这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定-淀粉酶的活力。因此可以根据淀粉培养基上透明圈的大小来判断所选菌株的淀粉酶活力。 1材料和方法1.1材料1.1.1实验材料长春师范学院家属楼前小菜园1.1.2实验药品碘液、2%可溶性淀粉、pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液、0.5mol/L乙酸、0.85%生理盐水。1.1.3实验仪器培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计。1.2方法1.2.1培养基的配置（1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至7.2，121灭菌15min，待冷却至50左右时，于超净工作台倒平板）（2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉 20g, 硝酸钾 1g, 磷酸氢二钾 0.5g, 氯化钠 0.5g, 硫酸镁 0.5g, 硫酸亚铁 0.01g, 琼脂 20g, 水 1000毫升，调整pH值到7.27.4。）（3）摇瓶培养：淀粉培养液。1.2.2实验步骤1.2.2.1淀粉产生菌的筛选：（1）采集土样，并用无菌水稀释成菌悬液；（2）配置牛肉膏蛋白胨固体培养基及淀粉培养基，倒平板备用；（3）将制好的菌悬液在超净工作台上涂到牛肉膏蛋白胨平板上，于37摄氏度培养箱中培养1天；（4）挑取整个菌落，将其移入淀粉培养基中，继续放在37摄氏度培养箱中培养两天；（5）将碘液滴在平板上，观察透明圈的大小。1.2.2.2酶活力测定（1）摇床培养选产生透明圈最大的菌株进行摇瓶培养，将菌溶于5ml无菌生理盐水中，吸取此培养液加入淀粉培养液中，30摄氏度摇瓶培养72h。（2）酶液稀释取发酵液进行4000r/min离心5min，取上清液，用缓冲液适当稀释。（3）标准曲线制作准备七支试管，按照下表配置混合液。使用分光光度计策规定各管溶液在660nm下的OD值。然后以淀粉浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，做标准曲线。（4）酶活力测定取稀释的粗酶液也按照下表中七号管的要求配置混合液，测得吸光度后，在标准曲线上查出相应的淀粉浓度，求出被酶消耗的淀粉量。表1 淀粉酶活力测定管号111234567（样品）淀粉稀释液/ml2(0%)2(0.2%)2(0.5%)2(1.0%)2(1.5%)2(2.0%)2(2.0%)缓冲液/ml111111140摄氏度水浴保温5min蒸馏水/ml1111110粗酶液/ml000000140摄氏度水浴保温30min，然后放入沸水浴5min稀碘液/ml1111111（5）酶活力测定酶活力以每毫升粗酶液在40摄氏度，pH6.0的条件下每小时所分解的淀粉毫克数来衡量。2实验结果2.1淀粉产生菌的筛选含有透明圈的即为淀粉产生菌2.2酶活力测定2.2.1实验原始数据管号123456700.0150.0400.0430.0220.0240.0552.2.2标准曲线：2.2.3计算样品的 =0.055查标准曲线可得：淀粉含量=0.055/0.0128=4.297mg初始淀粉含量=2g/100ml2ml=0.04g=40mg被消耗的淀粉含量=40mg4.297mg=35.703mg酶活力=35.703mg/(1ml0.5h)=18.8515 mg/(mlh)3实验结果分析实验结果因菌种特性、接种量大小、培养时间、酶的稳定性、温度范围、平板厚度等均影响平板菌落水解圈直径大小，所以有一定误差。绘制的淀粉含量标准曲线也会受到影响及误差而造成不准确。参考文献1吴根福、杨志坚.发酵工程实验指导.北京：高等教育出版社，2006. 2 王弋博,李博,李三相,张海林,金文晶. 异淀粉酶产生菌的分离纯化及生长特性. 青海师范大学学报，2003.3王丽丽，仪宏，田庄，李志军. A2淀粉酶产生菌的平板筛选法的研究与改进. 河北轻化工学院学报，1998.4李艳.发酵工程原理与技术.北京：高等教育出版社，2007.5吴燕萍、金其荣、李迅.微生物法生产普鲁兰酶的研究J .生物技术,1998，8(6):14-17.6袁勤生.应用酶学M.上海:华东理工大学出版社,1994.7江均平.热稳定的曲霉植酸酶.微生物学报.1996,36(6):476 478.8郭杰炎,蔡武城编著.微生物酶.北京: 科学出版社, 1986. 75 77.9邬显章.