一种酒糟饲料化活性菌剂的喷雾干燥工艺条件研究.doc

一种酒糟饲料化活性菌剂的喷雾干燥工艺条件研究摘 要 研究以乳酸菌和米曲霉组成降解酒糟的复合微生物系，探讨其活性菌剂的喷雾干燥最佳工艺条件。以干燥乳酸菌菌粉和米曲霉菌粉活菌数为评判标准，对喷雾干燥进风温度、出风温度、进料流量、保护剂的种类及配比设计单因素试验与正交试验。结果表明: 进风温度为 150 、进料流量为 50 r/min、菌液与保护剂配比为 11 及复合保护剂配比为 11 (10% 环糊精10% 麦芽浸粉)，为生产活性菌剂的喷雾干燥最佳工艺条件。该工艺条件下制备的乳酸菌菌粉和米曲霉菌粉活菌数分别达到 5. 2 亿和 7. 5 亿个/g 菌粉。关键词 乳酸菌 米曲霉 喷雾干燥 生物制剂 工艺条件开展清洁生产，发展可持续农业是 21 世纪可持续发展的目标。把容易造成环境污染的白酒糟、啤酒糟和酒精糟等发酵副产物及农作物下脚料综合利用生产高效价的菌体饲料，是推行清洁生产、发展生态农业、合理利用和节约资源及有效治理和保护环境的一条可持续发展之路。乳酸菌是动物体内的主要益生菌，能调整动物肠道菌群间的生理平衡，降低肠道内腐败菌的异常增殖及致病菌的入侵和定植，从而减少或消除体内毒素的产生，是一种天然的饲料添加剂和优良的发酵菌种来源。米曲霉的酶系比较丰富，包括纤维素酶、糖化酶、淀粉酶和果胶酶等。在发酵酒糟生产饲料的过程中，淀粉酶和糖化酶作用于原料的淀粉物质，使其充分分解为葡萄糖，增加饲料中的葡萄糖含量，易于动物吸收利用; 果胶酶和纤维素酶作用于原料外壁，使其内部的蛋白质等物质充分裸露，提高饲料中的蛋白质含量。同时米曲霉不会产生真菌毒素，因此是一种优良的发酵菌种。降解酒糟的复合微生物菌剂的开发，可简化酒糟发酵饲料的生产工艺，降低生产成本，提高发酵饲料质量，有利于酒糟发酵技术的推广应用，对酒糟发酵饲料产业化具有重要意义与长远的应用前景。根据前期研究基础和酒糟原料的特点，米曲霉及乳酸菌协同发酵能有效降解酒糟中的粗纤维，提高真蛋白含量。因此，选取米曲霉和乳酸菌为优良发酵菌种，组成酒糟降解复合微生物菌系，并通过喷雾干燥制备乳酸菌活性菌剂和米曲霉活性菌剂，以期为复合微生物菌剂发酵酒糟的工业化应用提供上游技术及产品，最终解决废弃酒糟再利用的难题，达到环境保护与经济增长的双重目的。1 材料与方法1.1 材料与试剂乳酸菌和米曲霉: 四川理工学院实验室保藏;牛肉膏蛋白胨培养基; 保护剂: 环糊精，成都市科龙化工试剂厂; 麦芽浸粉: 北京博奥生物技术有限责任公司; 脱脂奶粉: 伊利集团。1.2 仪器与设备ZHJH 2112B 水平流超静工作台，上海智城分析仪器制造有限公司; NSKY 2102C 恒温培养振荡器，上海苏坤实业有限公司; YC 015 实验型喷雾干燥机，上海雅程仪器设备有限公司; BS 2F 数控全温振荡培养箱，常州精诚国华仪器有限公司;科技动态70 饲料研究 FEED ESEACH NO. 12，2013DZX 50KA 压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂; SHB 循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司。1.3 试验方法1.3.1 乳酸菌扩大培养在 250 mL 三角瓶中装入 50 mL 牛肉膏蛋白胨培养基，68. 65 MPa，灭菌 20 min。冷却后，在无菌操作下，将培养48 h 的斜面菌种接5 环于250 mL 三角瓶中，于 30 旋转式摇床 150 r/min，振荡培养24 h。吸取 10 mL 一级扩培液接种于 250 mL 三角瓶中，于 30 旋转式摇床150 r/min，振荡培养24 h，即为二级扩培液。1.3.2 米曲霉扩大培养在 250 mL 三角瓶中装入 50 mL 察氏培养基，68. 65 MPa，灭菌 20 min。冷却后，在无菌操作下，用5 mL 无菌水洗脱培养72 h 的霉菌斜面得菌悬液，加入三角瓶中，于 30 旋转式摇床 150 r/min，振荡培养 24 h。吸取10 mL 一级扩培液接种于250 mL三角瓶中，于 30 旋转式摇床 150 r/min，振荡培养 24 h，即为二级扩培液。1.3.3 喷雾干燥制备菌剂将二级扩培菌液与保护剂混合，经喷雾干燥制得菌剂，收集菌粉，无菌包装好冷藏待用。试验的出风 温 度 控 制 在 80 100 。水 分 控 制 在 低于 10%。1.3.4 菌剂的感观指标分析通过对感观指标的分析 (观察颜色和闻其气味等) 初步判定干燥的效果。1.3.5 菌剂的菌体活性分析将干燥后所得的菌粉活化，经稀释和涂布后，采用平板菌落计数法测定活菌个数。2 结果与分析2.1 单因素试验2.1.1 进风温度对菌粉活菌数的影响因进风温度过高，单位时间内提供的热量越多，过多的热量导致微生物在喷雾干燥过程中大量死亡; 进风温度过低，出风温度达不到 80 ，菌剂水分大于 10%，很难收集和保存，所以试验选择150、170、190 和 210 ，作为进风温度进行试验。从表 1 可见: 随着进风温度的升高，菌粉的活菌数均出现了较为明显的波动变化，但最终呈递减趋势。考虑到活菌数与能耗，试验合适的进风温度约为 150 。表 1 进风温度单因素试验 个/g 菌粉项目 150 170 190 210 乳酸菌 380 万 206 万 420 万 66 万米曲霉 260 万 190 万 240 万 30 万2.1.2 进料流量对菌粉活菌数的影响分别取 50 mL 乳酸菌和米曲霉的二级扩培菌液和等体积的 10%脱脂乳溶液 (保护剂) 混合，进风温度设定为150 ，在50、60、70 和80 r/min 的进料流量下分别作喷雾干燥。表 2 进料流量单因素试验 个/g 菌粉项目 50 r/min 60 r/min 70 r/min 80 r/min乳酸菌 163 万 250 万 170 万 85 万米曲霉 77 万 735 万 807 万 100 万从表 2 可见: 在进风温度一定的情况下，随着进料流量的增大，乳酸菌粉活菌数量先增大后减小，在进料流量为 60 r/min 时，活菌数量最大; 米曲霉活菌数变化趋势与乳酸菌相当，在进料流量为70 r / min 时，活菌数量最大。这可能是由于当进料流量较小时，雾滴干燥完全，菌体在喷雾过程中与热空气接触时间短，存活率高; 随着进料量不断增大，超过 70 r/min 时，雾滴不断积蓄变大且在湿度较大的空气介质中，物料的干燥效果，出现黏壁和结块现象，此时雾滴与热空气的接触时间变长，活菌数下降。2.1.3 不同保护剂对微生物菌粉活菌数的影响选取的保护剂为: 10% 脱脂乳溶液，等比例混合的 10%脱脂乳溶液 + 10% 环糊精溶液，等比例混合的 10%的麦芽浸粉溶液 + 10% 环糊精溶液。将 3 种保护剂，分别加入到等体积的乳酸菌和米曲霉菌液中充分混合，在进风温度为 150 、进料流量为 60 r/min 的条件下作喷雾干燥，将所得菌粉活化，经稀释和涂布，检测活菌个数。表 3 保护剂种类单因素试验 个/g 菌粉项目10% 脱脂乳溶液10% 脱脂乳溶液 + 10% 环糊精溶液10% 的麦芽浸粉溶液 +10% 环糊精溶液乳酸菌 440 万 1. 50 亿 1. 50 亿米曲霉 560 万 8. 27 亿 10. 00 亿从表 3 可见: 使用混合保护剂比使用单一保护剂 (10%脱脂乳溶液) 效果更好，使用单一保护剂时，单克菌粉活菌数为 106数量级，而使用混合保科技动态饲料研究FEED ESEACH NO. 12，2013 71护剂时单克菌粉活菌数能够达到108数量级。而且，混合保护剂所得到的乳酸菌最高活菌数达到了 1. 50亿个/g 菌粉，米曲霉达到 10. 00 亿个/g 菌粉。但考虑到脱脂乳溶液包埋性能及保存性较差， 环糊精具有良好的生物相容性，且内部空腔具有疏水性，腔外羟基具有亲水性，这种特殊的分子结构使环糊精能够选择性地结合底物形成超分子，故选择10%的麦芽浸粉溶液 +10% 环糊精溶液作为保护剂。2.2 正交试验以进风温度、进料流量、菌液与保护剂配比和复合保护剂配比为试验因素，作 4 因素 3 水平正交试验 L9(34)。在试验中，乳酸菌和米曲霉菌液体积 (未加保护剂) 均为 50 mL，出风温度控制在80 100 ，保护剂采用质量分数都为 10% 的 环糊精溶液和麦芽浸粉溶液组合保护剂。表 4 正交试验因素水平表序号A进风温度/B 进料流量/(rmin 1)C 菌液与保护剂配比D 保护剂种类和配比(10% 环糊精10%麦芽浸粉)1 150 50 11 112 160 60 12 133 170 70 13 15从表 5 可见: 乳酸菌 4 个因素的极差大小顺序为菌液与保护剂配比进风温度复合保护剂配比进料流量。菌液与保护剂配比是影响乳酸菌单克菌粉活菌数的关键因素，这是由于在保护剂适量存在的情况下，保护剂的持水性和形成的网络，能避免细胞中的水分在干燥过程中不至于急剧下降，从而细胞蛋白结构不至于遭到破坏，保持较高的活菌数; 但当保护剂用量过大时，溶液变得黏稠，不利于喷雾干燥，菌液与保护剂的混合溶液会黏在干燥器的内壁上，影响乳酸菌的活菌数。由乳酸菌单克活菌 数 的 均 值 结 果 得 出 最 优 的 试 验 组 合 为A1B1C1D2，但经试验验证，活菌数不及试验 1 的结果 5. 20 亿个/g 菌粉多，因此选择试验 1 为最佳试验条件，此时水平组合为 A1B1C1D1，条件为进风温度为 150 、进料流量为 50 r/min、菌液与保护剂配比为 11 及复合保护剂配比为 11 (10% 环糊精10%麦芽浸粉)。从表 5 可见: 米曲霉 4 个因素的极差大小为菌液与保护剂配比进风温度进料流量复合保护剂配比。菌液与保护剂配比也是影响米曲霉单克菌粉活菌数的关键因素。由米曲霉单克活菌数的均值结果得出最优的试验组合为 A1B1C1D2，但经试验验证，此试验组合下的米曲霉活菌数不如试验 1 的活菌数 7. 5 亿个/g 菌粉多，因此选择试验 1 为最佳试验条件，此时水平组合为 A1B1C1D1，条件为进风温度为 150 、进料流量为 50 r/min、菌液与保护剂配比为 11 及复合保护剂配比为 11 (10% 环糊精10%麦芽浸粉)。3 结论进风温度是喷雾干燥加工菌粉时热量的主要来源，雾滴需要在喷雾干燥室内干燥完全就需要足够高的温度以提供热量，但并不是温度越高越好。因表 5 直观分析 个/g 菌粉序号 A B C D乳酸菌粉活菌数/(个g 1菌粉)米曲霉菌粉活菌数/(个g 1菌粉)1 1(150) 1 (50) 1 (11) 1 (11) 5. 20 亿 7. 50 亿2 150 2(60) 2 (12) 2 (13) 4. 55 亿 2. 90 亿3 150 3 (70) 3 (13) 3 (15) 2. 08 亿 4. 20 亿4 2(160) 50 12 15 2. 79 亿 5. 60 亿5 160 60 13 11 1. 30 亿 2. 50 亿6 160 70 11 13 4. 10 亿 3. 60 亿7 3 (170) 50 13 13 2. 20 亿 9. 00 亿8 170 60 11 15 3. 18 亿 4. 40 亿9 170 70 12 11 2. 23 亿 2. 00 亿乳酸菌数/(个g 菌粉) 3. 94 亿 3. 40 亿 4. 16 亿 2. 91 亿/(个g 菌粉) 2. 73 亿 3. 01 亿 3. 19 亿 3. 62 亿/(个g 菌粉) 2. 54 亿 2. 80 亿 1. 86 亿 2. 68 亿 / ( 个g 菌粉) 1. 40 亿 0. 60 亿 2. 30 亿 0. 94 亿米曲霉数/(个g 菌粉) 4. 35 亿 3. 80 亿 5. 11 亿 3. 62 亿/(个g 菌粉) 3. 93 亿 3. 75 亿 3. 53 亿 3. 84 亿/(个g 菌粉) 2. 50 亿 3. 22 亿 2. 13 亿 3. 31 亿 / ( 个g 菌粉) 1. 85 亿 0. 58 亿 2. 98 亿 0. 53 亿(下转第 75 页)科技动态饲料研究FEED ESEACH NO. 12，2013 75参考文献1马锦强，王天平，侯来宝 巴彦淖尔市向日葵发展存在的问题与对策 现代农业，2009(9):57 592陆彤迅，姜懋武，孙金堂 葵花粕的营养和饲用 饲料工业，1990(8):5 73孙庆杰，张运涛 番茄渣理化性质的分析 农牧产品开发，2000(7):16 184朱文涛，王加启，张继慧，等 添加不同比例番茄皮籽对奶牛生产性能的影响 中国奶牛，2007(51):60 625卢德勋，张吉鹃，李龙瑞，等 浅析粗饲料品质评定指数及其模型 畜牧与兽医，2004(4):34 356赵媛 巴彦淖尔市肉羊典型饲料营养价值评定及日粮配方筛选 呼和浩特:内蒙古农业大学，20117张吉鹃 反刍动物秸秆基础日粮补饲苜蓿的组合效应 中国奶牛，2007(5):16 198张旭晖，王恬 反刍动物饲料间的组合效应及其调控技术 新饲料，2008(5)，27 29通信地址: 内蒙古巴彦淖尔市临河区今日尊府49 号信箱檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪015000(上接第 71 页)进风温度过高，单位时间内提供的热量越多，过多的热量导致细菌在喷雾干燥过程中大量死亡; 进风温度过低，出风温度达不到 80 ，菌剂水分大于10% ，很难收集，所以研究单因素合适的进风温度约为 150 。使用混合保护剂比使用单一保护剂 (