蛋白质的免疫共沉淀的研究与发展.doc

附件4呼和浩特职业学院毕业论文(设计)学院名称:生物化学工程学院年 级:2009学 号:0930506224论文编号:题 目：蛋白质免疫沉淀的技术研究发展专 业: 生物技术及应用学生姓名: 吴靖学 号： 0930506224完成时间： 2012年03月01日指导教师： 吴娜 二零一二年三月 蛋白质免疫沉淀的技术研究发展【摘 要】免疫沉淀技术是检测蛋白质相互作用的经典方法，也是较常用的方法，文章对近10余年有关免疫沉淀技术原理和应用及优缺点的分析进行文献综述。 关键词： 免疫沉淀；蛋白质；相互作用；技术正文 蛋白质间的相互作用控制着大量的细胞活动事件，如细胞的增殖、分化和死亡。通过蛋白质见的相互作用可改变细胞内蛋白质的动力学特征。如底物结合特性、催化活性；也可产生新的结合位点，改变蛋白质对底物的特异性；还可失活其他蛋白质，调控其他基因表达。因此，只有使蛋白之间的相互作用顺利进行，细胞的正常生命活动过程才有保障。由于蛋白之间的相互作用具有如此重大的意义，因此，其检测方法的研究也备受重视，由生化方法，如蛋白质亲和层析、亲和印迹、免疫沉淀及交联，发展到当今的分子生物学方法，如以基因文库为基础的蛋白探测、噬菌体显示及双杂交系统等，另外还发展了可定性定量检测蛋白质相互作用的简便又快捷的方法，如表面胞质团共振等。通过这些方法的联合使用，实验得出的蛋白之间的相互作用的结论显的更为可靠。1 免疫沉淀的基本原理是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用； （3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。实验方法流程（1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白 免疫共沉淀酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4C， 最大转速离心30 min后取上清； （2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1g相应的抗体加入到细胞裂解液，4C缓慢摇晃孵育过夜； （3）取10l protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min； （4）将预处理过的10l protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连； （5）免疫沉淀反应后，在4C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗34次；最后加入15l的2SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟； （6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。 注意的问题： （1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2%SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。 （2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用 （3）使用对照抗体： 单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗 兔多克隆抗体：正常兔IgG 免疫沉淀技术的应用利用免疫共沉淀技术验证抗增殖蛋白(PHB)与HSP70间的相互作用,为研究应激时HSP70促进PHB进入线粒体的机制提供科学依据。方法采用Western blot方法检测HEK293细胞中PHB与HSP70的表达。构建抗增殖蛋白真核表达载体pEGFP-N1-PHB,经酶切鉴定正确后,将其转染HEK293细胞,采用荧光倒置显微镜观察转染效率。收集转染的HEK293细胞,利用免疫共沉淀技术验证PHB与HSP70之间的相互作用。结果在HEK293细胞中,HSP70具有较高的表达量,而PHB的表达量非常低。构建了抗增殖蛋白真核表达载体pEGFP-N1-PHB,转染HEK293细胞的效率达到90%以上。在抗体沉淀的PHB相互作用蛋白复合物中,可以检测到HSP70的存在。结论构建了抗增殖蛋白融合蛋白真核表达重组载体,在HEK293细胞中高表达抗增殖蛋白后,利用免疫共沉淀技术证实PHB与HSP70之间存在相互作用。 未知蛋白 HT036(Hypothetical protein HT036)是本研究小组前期利用酵母双杂交技术筛选出的 P311的相互作用蛋白,本实验拟利用免疫共沉淀技术来验证 HT036和 P311 间的相互作用。方法构建能在哺乳动物细胞中表达带 HA 标签的 HT036融合蛋白(HAHT036)的重组载体 pCMVHA-HT036,经酶切鉴定正确后,和表达带 Myc 标签的 P311融合蛋白(MycP311)的重组真核表达载体 pCMV-Myc-p311,单独或者共转染人293细胞,利用免疫共沉淀技术验证 HT036 与 P311间的相互作用。结果构建的重组表达载体 pCMV-HAHT036经双酶切鉴定正确,转染293 细胞,抗 Myc 单克隆抗体沉淀 MycP311相互作用蛋白复合物后,用抗 HA 单克隆抗体进行 WB 检测, 可以检测到 HAHT036的表达。结论成功构建了 HA-HT036融合蛋白真核表达重组载体,在哺乳动物细胞中表达后利用免疫共沉淀技术证实 HT036与 P311之间存在着相互作用。为进一步研究 P311 在细胞内的信号转导提供了重要依据。 2.免疫沉淀技术的应用 每种免疫沉淀方法都有一套固定的主要程序，以下将详细介绍。然而，为使分析方法多样化，常将免疫沉淀方法和其他方法相结合。例如，用免疫沉淀放射标记的细胞裂解物，可识别来源尚不确定的蛋白质，帮助研究者阐明某些争论问题，如确定相对分子量，寻找相关分子、蛋白质的修饰以及其半寿期等。若裂解物来源于未标记的细胞，免疫沉淀蛋白可以很容易地进行免疫印迹定量或酶活力分析。 免疫沉淀的各种改进方法可以用于测定抗原的许多重要特性。表列举各种改进方法及其应用于测定抗原各种特性的相应策略。 目 的特殊应用推荐程序抗原的相 在不含甲硫氨酸的S甲硫氨酸放射标记细胞对分子质量 免疫沉淀 SDSPAGE和拍照成相定位 相对标准的位点迁移抗原的定量大量抗原免疫杂交 大量抗原免疫沉淀 SDS-PAGE 考马氏蓝或银染 微量抗原未标记蛋白免疫沉淀 SDS-PAGE抗原降解率 特异抗体免疫杂交 在无甲硫氨酸溶液用短脉冲35s甲硫胺酸放射标记细胞 冷甲硫胺素跟踪 免疫沉淀 SDS-PAGE或拍照成相翻译后修饰任何磷酸化在无磷酸盐溶液用ARTHO_32p磷酸放射标记细胞 免疫沉淀 SDS-PAGE或拍照成相 酪氨酸磷酸化末标记蛋白的免疫沉淀 SDS-PAGE 抗酪氨酸磷酸化合物抗体免疫杂交 N糖在无葡萄糖溶液用3H甘露糖和3H半乳糖放射标记细胞 免疫沉淀 SDS-PAGE或拍照成相 O糖在无葡萄糖溶液用3H甘露糖和3H半乳糖放射标记细胞 免疫沉淀 相关蛋白SDS-PAGE或拍照成相 寻找潜在新抗35s甲硫氨酸放射标记细胞 原或研究已知免疫沉淀 相关蛋白SDS-PAGE或拍照成相 检查已知的相关性