重组中性植酸酶phy(ycD)的表达及其性质.doc

重组中性植酸酶phy（ycD）的表达及其性质【摘要】：植酸是豆类、谷类和油料作物等种子中磷的主要储存形式,植酸酶能够水解植酸生成无机磷和磷酸肌醇衍生物,在动物饲料中添加植酸酶可以有效地提高植酸中磷的利用效率、降低动物排泄物的环境磷污染,并能通过去除植酸的抗营养作用来提高饲料的营养价值,对具有高比活和良好热稳定性植酸酶的需求,促进了酶资源的开发利用以及植酸酶基因工程和蛋白质工程研究,也为更好应用于实践生产奠定基础。中性植酸酶也称p-螺旋桨植酸酶,主要来源于芽孢杆菌,是耐热性较好,最适反应pH呈中性(pH7.0-7.5),能够分解植酸释放磷元素,并且与金属离子有关的一类酶,尤其是Ca2+对于植酸酶酶活性及稳定性起到至关重要的作用。这一类植酸酶可在鲤科鱼类及单胃动物等pH值呈中性的肠道中起作用,而酸性植酸酶在中性pH条件下活性基本丧失,因此,中性植酸酶弥补了酸性植酸酶性质上的不足,可提高植酸酶在动物胃肠道的效用,拓宽植酸酶的应用范围。本文对前期已克隆到的中性植酸酶基因phy(ycD)进行表达纯化及性质研究,主要结果如下：将phy(ycD)基因连接到带有T7lac启动子的pET-28a(+)表达载体上,构建了原核表达质粒pET-28a(+)-phy(ycD),并在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG在16下进行了诱导表达,利用Ni-NAT亲和层析的方法纯化获得的融合蛋白r-phy(ycD),经SDS-PAGE分析和表达产物的研究表明：经诱导表达的酶蛋白几乎以可溶的形式存在,占可溶性蛋白的40%以上,纯化后蛋白纯度达90%以上,在SDS-PAGE胶上显示大小为45kDa的条带,酶活测定表明表达产物具有酶活性。对纯化后的植酸酶的酶学性质进行分析,该酶最适Ca2+浓度为1mM,其酶促反应的最适pH为6.5,最适反应温度为45,Km值和Vmax值分别为0.213mM和92.6nmolmg-1proteins-1。在65、pH6.5和浓度为1mMCa2+条件下处理20min,与37时相比,残余酶活为30%；在pH6.5、37和浓度为1mMCa2+条件下处理1h,残余酶活为60%；在60、pH6.5条件下孵育不同的时间,10mMCa2+浓度酶蛋白明显比0、1和5mMCa2+浓度酶蛋白的热稳定性好；该酶是Ca2+依赖性酶,1.0mMCa2+能显著提高酶蛋白的热稳定性和pH稳定性,EDTA、Zn2+、Ba2+和Fe2+对酶促反应均有显著抑制作用。综上所述,r-phy(ycD)酶学性质预示其在水产养殖业中的应用潜力,也为中性植酸酶产品的工业化生产奠定基础。因此,本研究具有重要的理论意义和实际应用价值。【关键词】：中性植酸酶基因表达酶学性质【学位授予单位】：山西大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2013【分类号】：Q78【目录】：中文摘要12-14ABSTRACT14-16第一章文献综述16-231.1植酸161.2植酸酶16-181.2.1植酸酶的定义16-171.2.2植酸酶的分类17-181.3中性植酸酶18-211.3.1中性植酸酶的来源18-191.3.2中性植酸酶一般酶学性质191.3.3中性植酸酶的结构和催化机制19-201.3.4中性植酸酶大肠杆菌表达系统201.3.5中性植酸酶的应用20-211.4本论文设计思路21-231.4.1本课题立题依据及研究进展21-221.4.2本研究的目的及意义22-23第二章植酸酶基因phy(ycD)的原核表达及纯化23-432.1实验材料23-262.1.1菌株和质粒232.1.2用于大肠杆菌表达的引物232.1.3主要试剂及溶液配制23-262.1.4主要实验仪器262.2实验方法26-342.2.1中性植酸酶基因phy(ycD)的克隆26-272.2.2中性植酸酶基因的亚克隆27-282.2.3植酸酶基因phy(ycD)PCR扩增产物与载体pGEM-T-easy的连接与转化282.2.4感受态细胞(Escherichiacoli)DH5的制备与转化28-292.2.5重组质粒的提取292.2.6重组质粒的酶切鉴定29-302.2.7阳性克隆的测序302.2.8植酸酶基因phy(ycD)表达载体的构建30-312.2.9重组质粒的鉴定312.2.10阳性表达子的筛选31-322.2.11表达载体pET-28a(+)-phy(ycD)在在大肠杆菌BL21(DE3)中的大量诱导表达322.2.12表达产物的酶活性测定32-332.2.13蛋白的纯化332.2.14表达产物的SDS-PAGE分析33-342.3结果与分析34-412.3.1克隆获得中性植酸酶基因及其序列测定34-352.3.2芽孢杆菌BacillussubtilisYCD植酸酶的信号肽切割位点预测35-362.3.3芽孢杆菌BacillussubtilisYCD植酸酶的结构模拟36-372.3.4芽孢杆菌BacillussubtilisYCD植酸酶蛋白的二级结构分析37-382.3.5中性植酸酶基因phy(ycD)的PCR扩增382.3.6表达载体pET-28a(+)-phy(ycD)的构建38-392.3.7重组质粒pET-28a(+)-phy(ycD)的酶切鉴定39-402.3.8中性植酸酶基因阳性表达子的筛选402.3.9表达产物的SDS-PAGE结果40-412.3.10凝胶过滤层析结果412.4讨论41-43第三章重组植酸酶phy(ycD)的性质43-593.1实验材料43-443.1.1主要生化试剂433.1.2主要试剂的配制43-443.1.3主要实验仪器443.2实验方法44-503.2.1钼蓝法测定植酸酶酶活性的方法443.2.2无机磷标准曲线的绘制443.2.3采用Bradford试剂盒法测定植酸酶蛋白的浓度44-453.2.4重组植酸酶比活的测定453.2.5Ca(2+)对酶活性的影响453.2.6最适酶促反应pH的测定453.2.7中性植酸酶pH稳定性45-463.2.8中性植酸酶最适反应温度463.2.9中性植酸酶热稳定性463.2.10Ca(2+)对纯r-phy(ycD)热稳定性的影响46-473.2.11一级反应时间与动力学参数的测定47-483.2.12纯酶r-phy(ycD)圆二色谱检测48-493.2.13不同化学试剂及金属离子对植酸酶活性的影响49-503.3实验结果50-573.3.1无机磷标准曲线的绘制503.3.2蛋白浓度标准曲线的绘制503.3.3纯酶r-phy(ycD)比活性的测定50-513.3.4Ca(2+)对酶活性的影响51-523.3.5酶活最适pH及pH稳定性523.3.6最适酶促反应温度及其热稳定性52-533.3.7不同浓度Ca(2+)对纯r-phy(ycD)热稳定性的影响53-543.3.8重组植酸酶r-phy(ycD)热恢复分析543.3.9动力学常数的测定54-553.3.10r-ph