DGGE实验方法.doc

DGGE实验方法一、 试剂准备（Reagent Preparation）1. 40% Acrylamide/Bis(37.5:1)ReagentAmountAcrylamide38.93gBis-acrylamide1.07gdH2OTo 100.0 ml2. 50 TAE BufferReagentAmountFinal ConcentrationTris base242.0g2 MAcetic acid, glacial57.1 ml1 M0.5 M EDTA, pH 8.0100.0 ml50 mMdH2OTo 1,000.0 mlMix. Autoclave for 20-30 minutes. Store at room temperature.3. 0% Denaturing Solution6% Gel8% Gel 10% Gel12% Gel40% Acrylamide/Bis15ml20ml25 ml30 ml50TAE Buffer2 ml2 ml2 ml2 mldH2O83 ml78 ml73 ml68 mlTotal volume100 ml100 ml100 ml100 mlDegas for 10-15 minutes. Filter through a 0.45 u filter. Store at 4 in a brown bottle for approximately 1 month. 100% Denaturing Solution6% Gel8% Gel10% Gel12% Gel40% Acrylamide/Bis15 ml20 ml25 ml30 ml50TAE Buffer2 ml2 ml2 ml2 mlFormamide(deionized)40 ml40 ml40 ml40 mlUrea42 g42 g42 g 42 gdH2OTo 100 mlTo 100 mlTo 100 mlTo 100 mlDegas for 10-15 minutes. Filter through a 0.45 u filter. Store at 4 in a brown bottle for approximately 1 month. A 100% denaturant solution requires re-dissolving after storage. Place the bottle in a warm bath and stir for faster results.4. For denaturing solutions less than 100%, use the volumes for acrylamide, TAE and water described above in the 100% Denaturing Solution. Use the amounts indicated below for urea and formamideDenaturing Solution10%20%30%40%50%60%70%80%90%Formamide(ml)4812162024283236Urea(g)4.28.412.616.82125.229.433.637.85. 10% Ammonium PersulfateReagentAmountAmmonium persulfate0.1 gdH2O1.0 mlStore at 20 for about a week.6. 2 Gel Loading DyeReagentAmountFinal Concentration2% Bromophenol blue0.25 ml0.05%2% Xylene cyanol0.25 ml0.05%100% Glycerol7.0 ml70%dH2O2.5 mlTotal volume10.0 mlStore at room temperature.7. 1 TAE Running BufferReagentAmount50 TAE buffer140 mldH2O6,860 mlTotal volume7,000 ml8.Denaturing gelGelReagentVolumeReagentVolume0%UF具体根据需要的变性范围按比例计算，共12.5 mlddH2O3.9ml100%UF50 TAE100 uLAPS25 uL40% Acrylamide1 mLTEMED15 uLAPS10 uL配制一个高浓度，一个低浓度，体积各12.5 mL，操作要迅速，配制时抽气和冰浴的必要性不大TEMED8 uL现用现配二、 DGGE 凝胶制备及电泳步骤（1） 仔细清洗玻璃板、塑料隔片和梳子，晾干水分，安装好玻璃板并固定到制胶底座上（短玻璃板面向自己，底座事先调水平），注意玻璃上缘与隔片、夹子平齐；（2） 各取High/Low concentration 两种变性剂12.5 mL，分别加入两个离心管中，加入交联剂（先加APS，再加TEMED），轻轻旋转混匀，吸入相应注射器中，排尽注射器中的气泡，并迅速安装到凝胶传送系统相应的位置上；（3） 将注射器上的塑料软管与Y形管相连，并用夹子将针头固定在长玻璃板上缘中央；（4） 轻柔并匀速推动旋转凸轮来传送凝胶液体，使胶缓慢匀速的注入两块玻璃板中间，速度不易太快，但也不能太慢，以防胶凝固注射器中，直至胶液面距离短玻璃板1厘米左右为止；（5） 迅速在胶液面上加封一层无菌蒸馏水，变性胶即灌制完毕。清洗注射器及传送管。40分钟后小心倒掉胶面上的水，并用吸水纸吸干；（6） 将梳子轻轻插入两块玻璃板之间，配制非变性胶，并用移液器迅速灌入两玻璃板之间，梳齿之间不能有气泡。（此时可打开电泳槽加热开关，预热电泳液至60 ）。30分钟后，小心拔去梳子，清洗点样孔，灌胶完成；（7） 将凝胶玻璃从制胶底座上取下，安装到电泳支架上，放入预热至60 的电泳槽内，盖上上层盖子；（8） 点样，将PCR产物减压浓缩至12uL，加入56uL ddH2O至总体积为7uL，加入7uL Dcode 2Loading buffer, 混匀，用移液器加入点样孔中，注意不要有气泡；（9） 调节电源电压为200V，电泳240分钟；（10） SYBR Green 染色； 将电泳支架从电泳槽中取出，卸下凝胶玻璃板，把玻璃板放在装有ddH2O的托盘中，将两侧的隔片取出，轻轻晃动托盘，使凝胶与短玻璃板脱离； 在一个50mL的离心管中加入30 mL 1 TAE，再加入 3 uL SYBR Green ，摇匀； 倒掉托盘中的水，将10mL 上述SYBR Green 倒在胶面上，均匀铺一层，置于避光处； 15min后，复染一次，前次染液不用倒掉； 三次染色后（每次10mL），向托盘中倒入ddH2O，浸没凝胶，轻轻晃动托盘，使凝胶和长玻璃板松动；（11） 紫外凝胶成像系统检测、照相；用长玻璃板托着凝胶，移至载胶台，倾斜玻璃板，使凝胶滑脱玻璃板，平铺在载胶台上，打开紫外灯，照相。三、 配制变性胶的注意事项（1） 配置试剂时一定要用去离子水，制胶时用的各个容器也要用去离子水洗涤干净，以防止氯离子污染。（2） 制胶是实验的