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成绩评定教师签名湖北工业大学本科课程期中考核考核形式：课程论文课程名称： DNA重组技术概论 学院： 轻工学院 专业： 生物工程 班级： 10生工2班 学号： 1010511222 姓名： 张杰 指导教师： 杨波 目录摘要：3前言：31.1 DNA重组技术的概述.31.2 DNA重组技术原理.41.3 DNA重组技术相关概念.41.4 DNA重组技术中的工具酶.51.5 DNA重组技术步骤.52 DNA重组技术的应用.72.1 DNA重组技术在药学方面的应用72.2 重组DNA技术在医药中的应用.73 DNA重组产品与人类.83.1 DNA重组产品与人类健康.83.2 DNA重组产品与农业生产.83.3 DNA重组产品与生态平衡.8结语. 9参考文献9 摘要 DNA重组技术就是采用人工手段将不同来源的DNA片段（含某种特定基因）进行重组，以达到改变生物基因型和获得特定基因产物的目的的一种生物高技术。70年代中后期由于出现了工程菌以及实现DNA重组和后处理都有工程化的性质，故基因工程或遗传工程作为DNA重组技术的代名词被广泛使用。80年代初，由于基因工程需重组DNA多拷贝复制，建立无性系，故“分子克隆”又被用作DNA重组技术的另一个代名词。在目前，基因工程还包括基因组的改造、核酸序列分析、分子进化分析、分子免疫学、基因克隆、基因诊断和基因治疗等等内容。可以说，DNA重组技术创立20多年来所获得的丰硕成果已经把人们带进了一个不可思议的梦幻科学世界，它给了人类打开生命奥秘和防病治病“魔盒”的钥匙，它为工业提供了光辉灿烂的奖品，它使农业从肥料和杀虫剂的束缚中解放出来，它还给世界一个清新的生态环境。前言 21世纪是生命科学的世纪，分子生物学是最前沿的生命科学，主要从分子水平研究生命活动的现象与本质，从20世纪40年代开始，无数生命科学家用他们的智慧和汗水，赢得里20世纪自然科学最伟大的革命揭开生物遗传的谜底。随着分子生物学研究的深入与发展，人类开始了从生物学的必然王国向自由王国的过度。DNA重组技术正越来越多的应用到广大领域中，如医药学、植物学、食品学、遗传学、生理学、进化论。本文将详细介绍DNA重组技术的概念、发展与应用。1.1DNA重组技术的概述DNA重组技术又称基因工程，是20世纪70年代初兴起的技术科学，目的是将不同的DNA片段（如某个基因或基因的一部分）按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。严格的说，DNA重组技术并不完全等于基因工程，因为后者还包括其他可能使生物细胞基因组结构得到改造的体系。DNA重组技术是核酸化学、蛋白质化学、酶工程及微生物学、遗传学、细胞学长期深入研究成果的结晶，而限制性内切酶、DNA连接酶及其他工具酶的发现与应用则是这一技术得以建立的关键。重组DNA技术来源于两个方面的基础理论研究限制性核酸内切酶（简称限制酶）和基因载体（简称载体）。 重组DNA技术中所用的载体主要是质粒和温和噬菌体两类，而在实际应用中的载体几乎都是经过改造的质粒或温和噬菌体。重组DNA技术中广泛应用的噬菌体是大肠杆菌的温和噬菌体 基因工程是在分子水平上对基基因进行操作的复杂技术，一般包括4个步骤：一是克隆目的基因，取得所需要的DNA特异片段；二是将目的基因与DNA载体连接成重组DNA；三是将重组DNA引入细菌或动植物细胞内使其增殖；四是将表达目的基因的受体细胞挑选出来，使目的基因表达相应的蛋白质或其他产物，从而育成动植物优良新品种(系)。1.2DNA重组技术原理 (1)载体和目的基因的分离(分):对载体DNA和目的基因分别进行分离纯化.目的基因的获取:常用化学合成法、基因组DNA文库、cDNA文库、聚合酶链反应.载体:质粒、噬菌体和病毒三大类载体均经人工构建,除去致病基因,有筛选的标志、单一的限制酶切点等.(2)载体和目的基因的切断(切):通常采用限制性核酸内切酶,分别对载体DNA和目的基因进行切断,以便于重组.(3)载体和目的基因的重组(接):即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来,得到重新组合后的DNA分子.黏性末端连接法;平端连接;同聚物加尾连接;人工接头连接法等.(4)重组DNA的转化和扩增(转):将重组DNA导入宿主细胞进行增殖或表达.导入重组DNA分子的方法有转化、转染和感染等.受体细胞为细菌时,常采用电穿击法、热击法等重组DNA导入宿主细胞后,即可在适当的培养条件下进行培养以扩增宿主细胞.(5)重组DNA的筛选和鉴定(筛):对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定.可根据重组体的表型、标志互补、DNA限制酶谱进行分析、核酸杂交法进行分析等方法鉴定.获得带目的基因的细菌后,可将其不断进行增殖,从而得到大量的目的基因片段用于分析研究.(6)克隆基因的表达:如在目的基因的上游带有启动子顺序,则目的基因还可转录表达合成蛋白质.1.3DNA重组技术相关概念 (1) DNA克隆:是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组,并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程,DNA克隆又称基因克隆.(2)工具酶:在重组DNA技术即基因工程技术中需应用某些基本酶类进行基因操作,称为工具酶.包括如DNA聚合酶、DNA连接酶、末端转移酶、反转录酶、多聚核苷酸激酶,而限制性核酸内切酶特别重要,应用最广.(3)限制性内切核酸酶:常用的为类酶,其特点:识别DNA的特异序列并切割;不同的酶识别核苷酸序列往往包含46个核苷酸;不同的酶切割DNA频率不同;可产生黏性或钝性末端.(4)目的基因:是指在基因工程中分离、获得的某一感兴趣的基因或 DNA序列.(5)基因载体:是指用以携带外源目的基因,实现外源DNA克隆及表达为有意义蛋白质而利用的DNA分子.常用基因载体包括质粒、噬菌体、病毒DNA等.1.4 DNA重组技术中的工具酶 在重组DNA技术中，常需要一些基本工具酶进行基因操作。小结：重组DNA技术常用工具酶（1）限制性内切酶：识别特异序列，切割DNA。（2）DNA连接酶：催化DNA中相邻的5磷酸基与3羟基间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合，连接DNA片段。（3）DNA聚合酶：a.合成双链cDNA中第二条链。b.缺口平移制做探针。c.DNA序列分析。d.填补3末端。（4）Taq酶催化PCR反应，聚合DNA。（5）反转录酶a.合成cDNA。b.替代DNA聚合酶进行填补，标记或DNA序列分析，（6）多聚核苷酸激酶催化DNA5羟基末端磷酸化，或标记探针。（7）碱性磷酸酶切除DNA5末端磷酸基。（8）末端转移酶在3羟基末端进行同系多聚核苷酸加尾。（9）DNA酶：切割DNA（10）RNA酶：切割RNA。1.5 DNA重组技术步骤 重组DNA技术一般包括四步：产生DNA片段；DNA片段与载体DNA分子相连接；将重组DNA分子导入宿主细胞；选出含有所需要的重组体DNA分子的宿主细胞。在具体工作中选择哪条技术路线。主要取决于基因的来源、基因本身的性质和该项遗传工程的目的。 重组DNA片段的取得主要的方法有：利用限制酶取得具有粘性末端或平整末端的DNA片段；用机械方法剪切取得具有平整末端的DNA片段，例如用超声波断裂双链DNA分子；经反向转录酶的作用从mRNA获得与mRNA顺序互补的DNA单链，然后再复制形成双链DNA（cDNA）。例如人的胰岛素和血红蛋白的结构基因都用这方法获得。这样获得的基因具有编码蛋白质的全部核苷酸顺序，但往往与原来位置在染色体上的基因在结构上有区别，它们不含有称为内含子的不编码蛋白质的间隔顺序（见基因）；用化学方法合成DNA片段。从蛋白质肽链的氨基酸顺序可以知道它的遗传密码。依照这密码用化学方法可以人工合成基因。DNA片段和载体的连接 DNA片段和载体相连接的方法主要有四种：粘性末端连接，每一种限制性核酸内切酶作用于DNA分子上的特定的识别顺序，许多酶作用的结果产生具有粘性末端的两个DNA片段。例如来自大肠杆菌（Escherichia coli）的限制酶EcoRI作用于识别顺序GAATTC CTTAAG（指示切点），产生具有粘性末端G CTTAA和AATTC G的片段。把所要克隆的DNA和载体DNA用同一种限制酶处理后再经DNA连接酶处理，就可以把它们连接起来。平整末端连接，某些限制性内切酶作用的结果产生不含粘性末端的平整末端。例如来自副流感嗜血杆菌（Hemophilus parainfluenzae）的限制酶Hpal作用于识别顺序GTTAAC CAATTG而产生末端为GTT GAA的DNA片段。用机械剪切方法取得的DNA片段的末端也是平整的。在某些连接酶（例如感染噬菌体T4后的大肠杆菌所产生的DNA连接酶）的作用下同样可以把两个这样的DNA片段连接起来。同聚末端连接，在脱氧核苷酸转移酶（也称末端转移酶）的作用下可以在DNA的3羧基端合成低聚多核苷酸。如果把所需要的DNA片段接上低聚腺嘌呤核苷酸，而把载体分子接上低聚胸腺嘧啶核苷酸，那么由于两者之间能形成互补氢键，同样可以通过DNA连接酶的作用而完成DNA片段和载体间的连接。人工接头分子连接，在两个平整末端DNA片段的一端接上用人工合成的寡聚核苷酸接头片段，这里面包含有某一限制酶的识别位点。经这一限制酶处理便可以得到具有粘性末端的两个DNA片段，进一步便可以用DNA连接酶把这样两个DNA分子连接起来。导入宿主细胞将连接有所需要的DNA的载体导入宿主细胞的常用方法有四种：转化，用质粒作载体所常用的方法。转染（见转化），用噬菌体DNA作载体所用的方法，这里所用的噬菌体DNA并没有包上它的外壳。转导，用噬菌体作载体所用的方法，这里所用的噬菌体DNA被包上了它的外壳，不过这外壳并不是在噬菌体感染过程中包上，而是在离体情况下包上的，所以称为离体包装。注射，如果宿主是比较大的动植物细胞则可以用注射方法把重组DNA分子导入。2DNA重组技术的应用 自1972年DNA重组技术诞生以来，基因工程技术得到飞速发展，并作为现代生物技术的核心服务人类。基因工程技术不仅在工农业发展中起到了越来越重要的作用，而且在与国计民生有关的医疗领域中也展露出独特的优越性。基因工程药物就是利用基因工程技术生产的药物。2.1DNA重组技术在药学方面的应用 基因工程药物利用基因工程技术开发新型治疗药物是当前最活跃和发展最快的领域。自1982年世界第一个基因工程药物重组胰岛素投放市场以来，基因工程药物就成为制药行业的一支奇兵，每年平均有3-4个新药或疫苗问世，开发成功的约50个药品，诸如人胰岛素、人尿激酶、人生长激素、干扰素、激活剂、乙肝疫苗等已广泛应用于治疗癌症、肝炎、发育不良、糖尿病和一些遗传病上，在很多领域特别是疑难病症上，起到了传统化学药物难以达到的作用。目前，重组DNA技术的应用在这方面相当活跃。现已利用重组DNA技术生产出各类产品：激素类：胰岛素、生长激素、生长激素抑制剂等；生理活性剂：干扰素、白细胞介素、淋巴细胞活素等；疫苗类：乙型肝炎病毒疫苗、流感病毒疫苗等；酶类：蛋白酶、糖化酶、溶菌酶、尿激酶、凝乳酶等；蛋白质：胶原蛋白、血清蛋白等。其它类产品：氨基酸、维生素、核昔、多糖、抗生素、有机酸、微生物菌体、醇类等，都可用重组DNA技术生产，充分显示了这种技术的商业价值。近年来，我国学者在重组DNA技术上却有着可喜的进展。例如：侯纬敏等分子克隆人血小板生成素基因成功；舒东等成功构建并获得高效表达抗人纤维蛋白单链抗体一低分子量尿激酶双功能事例蛋白的细胞株。曾宗浩等制备出长效胰岛素目标产品。孔祥平等制备了促肝细胞生长单克隆抗体等，为我国应用重组DNA技术的工业生产提供了丰富素材。2.2重组DNA技术在医药中的应用 基因诊断基因诊断开始于20世纪90年代。它是运用基因手段诊断，从基因中寻找病根，旨在为一些“不治之症”寻找新的诊断渠道。其特点是特异性非常强，只要检测出该病变基因的存在，就能确诊。目前，聚合酶链式反应的基因诊断技术是在基因水平上对人体疾病进行诊断的最新技术。从原理上说，医生只要拥有适当的工具“探针”，就可正确诊断任何一种基因疾病，而且不论该基因是否产生相应的蛋白质。此法诊断已经不限于癌症的诊断，也用于产前诊断和症状前诊断。我国已具有对珠蛋白基因缺陷性贫血、苯丙酮尿症、血友病、杜氏肌营养不良症等遗传疾病进行基因诊断的能力。DNA化学合成的完善和自动化，DNA扩增技术的优化，为合成基因探针，提高临床诊断的质量，是人来所殷切企盼的。3DNA重组产品与人类3.1DNA重组产品与人类健康 人们担心转基因生物产品可能对人类健康产生的潜在影响主要有以下几个方面：1.担心外源基因是否会通过“异源重组”或“异源包装”进入人的遗传体系中。但专家们认为这种可能只是在理论上具有极小的概率。2.担心由“异源重组”或“异源包装”所产生的具有“超级抗性”的病原微生物会危害人类健康。此种现象的发生在使用“抗生素标记基因”时有很小的可能，但随着“Markerfree技术”及更安全的标记基因的使用，这种担忧可被解除。3.担心转基因食品是否有毒性，尚无关于人体的研究报告。转基因食品引起人体过敏性反应的发生概率想对高一些，但与之相应的过敏源检测和安全管理也更加完善和严格。3.2DNA重组产品与农业生产 转基因生物产品目前主要在农业生产中研究和应用，公众对安全性问题可能给农业带来的种种影响十分关注。主要问题有：1.担心出现具有多种抗性基因的作物花粉与近缘属杂交，导致“超级杂草”的产生。2.担心出现具有高度抗药性的农业害虫。关于此类问题的报道具有一定的实验依据，但随着科学技术的进步可以通过转双价基因和一定的种植手段逐步解决，其实具有抗性的害虫出现不仅仅是由于抗虫转基因作物的种植，农药的使用也同样会使害虫的抗药性增强，这是人工选择抗性突变体的结果。3.但心“病毒重组”或“异源包装”会产生新的农作物病原物。此类现象在自然界可以发生，在实验室中叶曾获得验证，但在田间尚无报道。3.3DNA重组产品与生态平衡 保护生态平衡是目前全球最为沉重的话题。在生物进化的过程中，不同物种之间的遗传物质交流极为缓慢。转基因技术的应用使这种基因交流的频率成倍提高。人们担心转基因生物的释放会对人类的生存环境产生不利影响。转基因生物进入自然环境的主要途径和影响：1.转基因植物被推广种植后，释放到自然环境中的机会加大，转基因植物因具有较野生种更为广泛的各种抗性，