切片标本的制作.doc

切片标本的制作本次实验采用的是石蜡切片法。石蜡切片法的程序如下：取材固定冲洗（洗涤）脱水透明包埋切片贴片烘片脱蜡复水染色脱水透明封藏。上述每个程序的要求和方法可归纳为透蜡制片和染色两大步骤，现简单介绍如下：脱水步骤为：将组织块浸入系列酒精70%80%95%100%100%各30min。脱水的实际时间长短视组织块的大小而定，但不宜过长。透明步骤为：将组织块浸入二甲苯与无水乙醇（1：1）的混合液30min二甲苯30min二甲苯30min。透蜡步骤为：将组织块浸入二甲苯与石蜡（1：1）的混合液30min石蜡30min石蜡30min。脱蜡程序为：纯二甲苯（脱蜡）15min纯二甲苯15min二甲苯：纯乙醇（1：1）3min复水程序为：纯乙醇3min95%乙醇3min90%乙醇3min80%乙醇3min70%乙醇3min60%乙醇3min50%乙醇3min30%乙醇3min蒸馏水H、E染色程序为：将已复水的切片放入苏木精染液中（30分钟以上），水洗2分钟，在05%的盐酸水中分色3秒（当在显微镜下检查时，核褪至淡红色，细胞质及结缔组织几近无色即可）蒸馏水洗1分钟，01%氨水中蓝化（13分钟，核呈蓝紫色），蒸馏水洗（1分钟），切片由低至高浓度的系列酒精中脱水（每级35分钟）至95%乙醇切片入05%伊红中复染（3分钟）（伊红由95%乙醇配制的）95%乙醇中分色（显微镜检查呈蓝紫色，胞质及结缔组织为粉红色）95%乙醇轻洗（除去玻片上多余的伊红染液。动作要迅速，否则组织上的伊红要脱下来）。透明程序为：将已脱水的切片依次放入纯乙醇：二甲苯（1：1）二甲苯二甲苯中，每级15分钟。1 21透蜡制片1211、取材 从实验罗非鱼最后一根背鳍下方用解剖刀取下334mm左右的新鲜肌肉块取材时要注意组织块方向与肌纤维走向要一致。同时，取材时动作迅速，保持组织的新鲜，取材所用的解剖刀要锋利。1212、固定 把取下的肌肉组织块迅速投入已预先配制好的Bouin,s固定剂中固定。固定剂中的药品可以使构成组织的蛋白质变性凝结，组织块硬化，从而保持组织及细胞的原来形态结构。Bouin,s固定剂配方如下：苦味酸饱和溶液 75ml 福尔马林 25 ml 冰醋酸 5 ml 1213、冲洗（洗涤） 肌肉块经固定剂的处理，会在肌肉的表面或内部残留着组织液，这些残留的药品若不除去，将会对以后的制片过程产生不良影响，所以肌肉从固定剂中取出后，必须经流水冲洗或数次的乙醇洗涤，使得组织中残留的固定剂全部除去为止。1214、脱水 脱水的目的在于去除肌肉中的水分。在石蜡制片法中所用的渗透和包埋剂就是石蜡，由于石蜡和水是不相溶的。因此为了使石蜡能很好地渗透进肌肉组织的每个部分，就必须先把肌纤维细胞中的水分除去，在脱水时要用从低浓度到高浓度的系列酒精逐步脱水，这样可避免肌纤维因脱水而过分地收缩。脱水需彻底。脱水步骤为：将组织块浸入系列酒精70%80%95%100%100%各30min。脱水的实际时间长短视组织块的大小而定，但不宜过长。1215、透明 肌肉组织经脱水后，石蜡也不能直接渗透进肌肉组织。此时还必须将肌肉块中所含的乙醇除去，除去乙醇的药品必须既能很好的与乙醇相溶，又能与石蜡相溶。经这种药品处理过的肌肉，使肌肉呈现透明状，所以称为透明剂。因此，这种处理程序就叫透明。这里采用的透明剂是二甲苯。当肌肉组织中的乙醇被透明剂替代后，肌肉组织才能透蜡包埋。透明步骤为：将组织块浸入二甲苯与无水乙醇（1：1）的混合液30min二甲苯30min二甲苯30min。1216、透蜡 透蜡是使包埋剂透入进肌肉组织的各个部分的过程。透蜡是肌肉组织可在切片机上制作切片的需要。石蜡在常温下呈固体状，它是具有一定的熔点，透蜡时必须使石蜡熔化为液体状态才能使石蜡渗入肌肉组织组织，所以透蜡过程必须在恒温箱中进行。透蜡步骤为：将组织块浸入二甲苯与石蜡（1：1）的混合液30min石蜡30min石蜡30min。1217、包埋 将完成透蜡程序的肌肉组织块包埋在含有石蜡的小纸盒内，便于保存及制作薄的石蜡切片。包埋时把熔化的石蜡倒入小容器内，然后迅速夹取肌肉组织放入小容器中，并适当调整肌肉组织块的位置和方向，待容器中的石蜡迅速凝成蜡块。1218、切片 肌肉组织块经上述各程序的处理后，不仅变得较硬，而且有了石蜡的支撑，经修整后便可以放在切片机上切成极薄的石蜡切片。切片的厚度为8um。1219、贴片 把由切片机上切下的含有肌肉组织的蜡条割成小段，再将小段蜡条安放在均匀涂过蛋白质的载玻片上，滴上蒸馏水使其在展片台上加热，在加热过程中使蜡条适当地伸展开，以此使组织伸展平正，然后把玻片上多余的水分去掉。12110、烘片 把贴好蜡片的载玻片置于37的恒温箱中烘烤24小时以上，使切片干燥。122 染色以下各步骤均需在染色缸中进行，所以需预先准备好一套清洁的染色缸，分别贴上系列标签并加入相应的药品。1221、脱蜡 通过切片、贴片及烘片后，肌肉组织仍埋藏在蜡中，为了使肌肉组织顺利染上色，必须先将肌肉组织切片上的蜡去掉，因此要把贴片烘干后的的玻片放入含有二甲苯的染色缸内，使蜡溶解在二甲苯中。脱蜡程序为：纯二甲苯（脱蜡）15min纯二甲苯15min二甲苯：纯乙醇（1：1）3min1222、复水 在肌肉组织透蜡包埋前已把肌肉组织中的水去除干净了，而没有经过复水处理的肌肉组织切片不能放入水溶性的染料中染色，所以染色前肌肉组织切片中必须经复水处理，也就是使得肌肉组织中含有水分。肌肉组织切片复水过程必须逐渐进行，即从纯乙醇经下降的各浓度系列酒精直至水，每级35分钟。在水中的放置时间要稍加长，大约10分钟以上，苏木精染液才能上色。复水程序为：纯乙醇3min95%乙醇3min90%乙醇3min80%乙醇3min70%乙醇3min60%乙醇3min50%乙醇3min30%乙醇3min蒸馏水1223、染色 组织或细胞的许多结构在自然状态下是无色或具有很淡的颜色的，要区分出组织和细胞的各种结构是极为困难的，为了更好地对组织的各种结构进行观察，必须染色。染色时将切片放入预先制好的染色剂内，根据不同的目的、不同的染色剂的要求染色一定时间后取出切片，切片再行水洗、分色或复染等程序的处理。本实验的染色采用苏木精（hematoxylin）、伊红（eosin）染色法，简称为H、E染色法。苏木精是一种碱性染料，组织或细胞中由酸性物质构成的结构，如细胞核中的核酸等可被它染成蓝紫色。组织或细胞中可被碱性染料着色的结构或成分称为嗜碱性。根据配制方法的不同，苏木精可配成多种苏木精染料。伊红是一种酸性染料，细胞中由碱性物质构成的结构可被染成红色或粉红色（如细胞质），这种结构或成分称为嗜酸性物质。H、E染色程序为：将已复水的切片放入苏木精染液中（30分钟以上），水洗2分钟，在05%的盐酸水中分色3秒（当在显微镜下检查时，核褪至淡红色，细胞质及结缔组织几近无色即可）蒸馏水洗1分钟，01%氨水中蓝化（13分钟，核呈蓝紫色），蒸馏水洗（1分钟），切片由低至高浓度的系列酒精中脱水（每级35分钟）至95%乙醇切片入05%伊红中复染（3分钟）（伊红由95%乙醇配制的）95%乙醇中分色（显微镜检查呈蓝紫色，胞质及结缔组织为粉红色）95%乙醇轻洗（除去玻片上多余的伊红染液。动作要迅速，否则组织上的伊红要脱下来）。1224、脱水 为了长久保存切片，已染色的切片必须脱水才能封藏。所以切片再入纯乙醇中脱水两次。脱水程序为：纯乙醇纯乙醇1225、透明 为了更有利于对组织和细胞的内部结构进行观察分析，还必须