（微生物学专业论文）枯草芽胞杆菌固态发酵产聚γ谷氨酸的工艺优化.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 石 如需保密，解密时间年月日 是否保密 口 独创- 性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生鲐季、永孚 i 甘i 1 ：z o o7 年，月日 学位论文使用授权书 挠关* 寻名：k 知 签名日期：2 一。7 年，月7 日 签名日期： 伊f 年 月，9 日 华中农业大学硕士学位论文2 0 0 6 摘要 聚吖谷氨酸 p o l y 一( 7 - g l u t a m i ca c i d ) ，7 - p g a 是一种天然的水溶性的聚合氨基酸， 具有生物可降解性，对人体和环境无毒害等优点。7 - p g a 及其衍生物可应用于农业、 食品、饲料、化工、材料、药物等领域，是一种极具开发前景的多功能新型生物材 料。 本课题首先优化了本实验室分离的一株高产t p g a 的枯草芽胞杆菌m e 7 1 4 的 固态发酵培养基。运用单因素实验、正交实验以及神经网络和遗传算法进行培养工 艺优化。结果表明，黄豆饼粉和麸皮是适合枯草芽胞杆菌m e 7 1 4 产y p g a 的固态发 酵基质，其质量比为1 ：1 ，2 5 0 m l 摇瓶固体基质装量为1 0 9 ：无机盐的种类和浓度为 硫酸锌0 3 6g k g ，硫酸锰0 1g k g ，硫酸镁0 5g k g ，氯化钙0 2g k g ；谷氨酸钠3 1 8 g k g 、尿素2 8 3 ，g k g 、柠檬酸钠2 4g k g 、淀粉4 6 9 k g ；料水比为1 ：1 ，初始p h 值8 0 ， 接种量8 ，发酵时间3 6 h ，过程中不翻曲；优化条件下t p g a 产量为7 5 3g k g 。 进一步进行了扩大培养的初步研究。珍珠岩和谷壳作为载体均可在扩大培养条 件下获得较好的t p g a 产量。谷壳作载体可以将产量提高8 6 ；珍珠岩作载体时， 产量提高了1 1 1 。 本课题以昆明小鼠为材料初步研究了添加v - p g a 的混合饲料对不同周龄的小鼠 生长的影响。结果表明，添加5e c k 9 7 - p g a 的混合饲料对5 6 周龄小鼠的生长有明显 的促进作用，增重作用显著；对3 4 周龄小鼠，饲料中添加5g k 9 7 - p g a 对其生长有 极显著的抑制作用，添加2 5g k g ? - p g a 对这个时期小鼠生长的影响也是显著的。 关键词：聚y 谷氨酸；固体发酵；扩大培养；载体：昆明小鼠 华中农业人学硕l 学位论文2 0 0 6 a b s t r a c t p o l y “一g l u t a m i ca c i d ) ( t - p g a ) i saw a t e rs o l u b l ep o l ya m i n oa c i d sw h i c hh a v e e x c e l l e n tc h a r a c t e r ss u c h a s c o m p l e t e l yb i o d e g r a d a b l e ，n o n - t o x i c t oh u m a na n d e n v i r o n m e n t 7 - p g aa n di t sd e r i v a t e sh a v ep o t e n t i a la p p l i c a t i o n si naw i d er a n g eo f i n d u s t r ya n da g r i c u l t u r es u c ha sf o o d ，c o s m e t i c s ，m e d i c i n ea n dm a n u r e t h u st h i sn a t u r a l a n dm u l t i f u n c t i o n a lb i o p o l y m e ri sw o r t hr e s e a r c h i n ga n dd e v e l o p i n gt oac o m m e r c i a l m a t e r i a l t h es o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o nm e d i u mo f 丫p g ab i o s y n t h e s i sb yb a c i l l u ss u b t i l 西 m e 7 1 4 ，w h i c hw a san e w l yi s o l a t e ds t r a i nb yo u rl a b ，w a so p t i m i z e d m e t h o d ss u c h 髂 s i m p l ef a c t o re x p e r i m e n t ，o r t h o g o n a ld e s i g n ，r b f n e u r a ln e t w o r ka n dg e n e t i ca l g o r i t h m w e r ei n v o l v e di nt h i sw o r k t h eh i g h e r1 - p g ay i e l dw a sa c h i e v e di nt h ec o n d i t i o n st h a t d e s c r i b e da sf o l l o w i n g ( g k g ) ：s o y b e a nc a k ep o w d e ra n dw h e a tb r a n ( 5 ：5w w ) a st h e m i x e ds u b s t r a t e ss u p p l e m e n t e dw i t hs o d i u mg l u t a m a t e ( 3 1 8g k g ) ，u r e a ( 2 8 3g k g ) ， t r i s o d i u mc i t r a t e ( 2 4g k g ) ，s t a r c h4 6 ( e # g ) a n dm i n e r a ls a l t s ( z n s 0 40 3 6e c k g ，m n s 0 4 0 1 g & g ，m g s 0 4 0 5g k g ，c a c l 20 2g k g ) ，w i t hi n i t i a lr a t i oo fs u b s t r a t ew e i g h t ( g ) a n d s o l u t i o nv o l u m e ( m l ) l ：1 ，i n i t i a lp h8 0 ，i n o c u l u ml e v e l8 ，a t3 t ci n c u b a t e d3 6 h n o s u b s t r a t ed i s t u r b a n c ew a s m a d ed u r i n gt h ec u l t i v a t i o n t h ey i e l di s7 5 3e c k g ，w h i c hi s i n c r e a s e db y4 3 16 c o m p a r e dt ot h eo r i g i n a lm e d i u m s c a l e u po f7 - p g ab i o s y n t h e s i sw a sd e v o l p e d b o t hp e r l i t ea n dc h a f fa sc a r r i e r s h a v ew e l lp e r f o r m a n c ed u r i n gs c a l e - u pc u l t i v a t i o no f7 - p g a t h ey i e l di si n c r e a s e db y 8 6 。w h e nc h a f f w a s a p p l i e d ，1 1 1 f o r p e r l i t e ，c o m p a r e d t o o r i g i n a lc u l t u r e i n t h i sr e s e a r c h ，e f f e c to f 7 - p g ac o n c e n t r a t i o ni nt h ea n i m a lf e e do nk u n m i n gm i c e g r o w t hw a si n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e da n i m a lf e e dc o n t a i n i n g5e d k g7 - p g a h a d m a r k e d l yi n c r e a s e dt h ew e i g h to f 5 - - 6w e e k so l dm i c e ，w h i l ei n h i b i t e dt h eg r o w t ho f3 4 w e e k so l dm i c e f e e d i n g 、v i m2 5g m gy - p g aa l s oh a ss t a t i s t i c a lr e v e r s ee f f e c to nt h e g r o w t ho f3 4w e e k so l dm i c e k e y w o r d s ：y - p g a ；s o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o n ；s c a l e u p ；c a r r i e r ；k u n m i n gm i c e 2 华中农业大学硕士学位论文2 0 0 6 第一章文献综述 1 y p g a 的性质 7 - p g a 是由l - 谷氨酸或d 一谷氨酸通过一氨基和t 一羧基间的酰胺键结合而成的 阴离子型多聚氨基酸，结构如图1 1 所示，在每一个重复单元的a 一碳原子还有一 个游离的羧基( g r o s se t a l ，1 9 9 5 ；c r o r n w i c ke t a t , 1 9 9 5 b ) 。其分子量通常很大( 2 0 0 ， 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 ) ，基本骨架呈直链纤维状( a s b _ i u c h ie ta l ，2 0 0 3 b ；k u n i o k a , 1 9 9 7 ) ， 在自然界或人体内能生物降解成内源性物质谷氨酸，不会产生蓄积和毒副作用，是 一种理想的可生物降解的高分子材料。 - ( - - - n l f i f i f i i 一咖 0 o h 图i i ? - p g a 的结构式 f i g 1 1t h es t r u c t u r a lf o r m u l ao f 7 - p g a 7 - p g a 的分子链上具有大量的活性较高的游离侧链羧基，可在分子内部或分子 之间形成氢键，因此具有极高的水溶性和吸水保湿性，也为阳离子的结合提供了基 团，使其对金属离子具有良好的吸附性。羧基是容易发生酯化反应的活性基团，利 用这一性质可以使7 - p g a 与交联剂发生交联反应生成性能优良的吸水树脂，或者让 羟基与某些药物成分的基团发生反应，从而使7 - p g a 成为药物载体或者缓释剂。 2 丫一p g a 的生产 2 1 化学合成法 传统的多肽合成方法一般包括基团保护、活化、偶接、和脱保护等步骤，合成 路线长，副产物多，收率低。因此这种方法无法获得高纯度的能用作医用或食用的 聚谷氨酸，限制了它的应用。 华中农业人学硕士学位论文2 0 0 6 2 2 提取法 过去，日本生产t - p g a 大多采用乙醇将纳豆中的t - p g a 分离提取出来的方法。 但由于纳豆中y p g a 的量很少，且还有大量副产物的存在，如分子量1 5 0 0 0 左右的 果聚糖，使得提取工艺复杂，生产成本很高，难以大规模生产。 2 3 微生物发酵法 i v a n o v i c s ( 1 9 3 7 ) 等在病原菌炭疽杆菌( 且a n t h r a c i s ) 的荚膜中首次发现了y p g a 。 此后在一些非致病性的芽胞杆菌属革兰氏阳性菌的荚膜中也发现了t - p g a 的存在 ( a u m a y re ta l ，1 9 8 1 ；k a m b o u r o v ae ta t , 2 0 0 1 ) 。除芽胞杆菌属外，嗜热真细菌 s p o r o s a r c i n ah a l o p h i l a 、p l a n o c o c c u sh a l o p h i l a 和嗜热古细菌n a t r i a l b aa e g y p t i a c as p h o es t r4 0 也能产生7 - - p g a ，另外在一些嗜碱杆菌的细胞壁中也发现有t - p g a 的存 在( k a n d l e re ta l ，1 9 8 3 ；h e z a y e ne ta l ，2 0 0 0 ) 。 微生物发酵法较前两种方法生产成本低且生产过程对环境污染小，适合大规模 生产，所以采用微生物发酵法生产? - p g a 成为研究方向的主流，也是最具有应用前 景的一种生产方法。 2 3 1 产生菌 根据培养基中是否需要提供谷氨酸，将y p g a 产生菌分为两类：一类是需要 在培养基中加入少量的谷氨酸，如丑j “6 盯胁a t c c 9 9 4 5 ，b s u b t i l i si f 0 3 3 3 5 ，b s u b a l 括f 一2 o l 等；另一类是不需要在培养基中加入谷氨酸，如且s u b t i l i s5 e ，占 s u b t i l i s t a m - 4 ，bl i c h e n r i f o r m i s a 3 5 等( i t oe t a l ，1 9 9 6 ；t s u b o k a w a e l a t , 1 9 9 3 ：k u b o t a , 1 9 9 3 b ) ，但有些菌也有其特殊的营养要求，如b s u b t i l 括5 e 需要脯氨酸，b s u b t i l 括 t a m 4 需要铵盐和蔗糖。表1 1 给出了7 - p g a 产生菌的有关内容。 2 3 2 合成机制 微生物合成一种物质的机理研究很重要。但y - p g a 合成机制至今还不是很清楚， 且不同的产生菌株间表现有较大差异。目前关于t p g a 合成机制研究主要集中在两 方面：( 1 ) 谷氨酸在1 - p g a 合成中的作用；( 2 ) y - p g a 中d 一谷氨酸和l 一谷氨酸组 成的变化机理。 华中农业大学硕士学位论文2 0 0 6 表1 1r p g a 产生菌概况 t a b l e1 1i n t r o d u c t i o na b o u t7 - p g a p r o d u c i n gb a c t e r i a 菌株及作者培养基成分g l - l培养方法分子量d - l 一产量g l b ，s u b t i l i s1 a m - 4 葡萄糖7 5n h 1 1 8l ( 2 p o | 1 5 l t op f a l 1 9 9 6 m 9 5 0 , 7 8 - 00 3 5 c a c o ，3 0 g n s o 5 啪0 0 5 b 1 i c h e n i f o r m i sa 3 5葡萄糖7 5i 岈1 f 11 8 c h e n gc “a , 1 9 8 9其它无帆盐 bs u b t i l i sf 2 叭 葡萄糖8 0 酵母膏5 明治制果公司1 9 8 9蛋白胨1 5 尿素3 1 9 9 3谷氨酸7 如p 也2 b s u b t i l i sm r 一1 4 1麦芽塘( 或葡萄糖) 6 0 9 | 罔火学，1 9 9 7大豆汁7 0 谷氨酸钠3 0 b ，l i c h e n i f o r m i s a t c c 9 9 4 5 a g r o s s a1 9 9 6 , 1 9 9 8 岫o 2 5m g s o 。7 t i ) 0 ，5 柠檬酸1 2 甘油8 0 谷氨酸2 0 n i | c l7 g g s o 7 h 2 00 5 p o 0 5f e c i ，6 f i f o0 ，驰 m n s 0 5 h z 00 ic a c l t 2 k 00 1 5 b 1 i c h e n i f o r m i s 同上 毒s u b t i t i si f 0 3 3 3 5 柠檬酸2 0 一5 0 d - a j j n i n ： 0 3 0 1 1回 h n ( ( ；i l l 氮基转移酶谷氮酰胺合成酶氨基转移酶渭旋酶 氪基转移酶 y p g a 合成酶 图i 3 且s u b t i l i si f 0 3 3 3 5 的7 - p g a 合成图 f i g 1 3p r o p o s e dp a t h w a yo f l - p g as y n t h e s i si n 置s u b t i l i si f 0 3 3 3 5 从d 一酮戊二酸至i j l - 谷氨酸有两个途径：1 ) 谷氨酸脱氢酶( g d ) 途径：2 ) 谷氨酰 胺合成酶( g s ) 和谷氨酰胺：q 一酮戊二酸氨基转移酶( g o g a t ) 途径。b s u b t i l i s i f 0 3 3 3 5 合成y p g a 代谢途径是第二个途径。利用n m r 技术通过标记的l 一谷氨酸和 柠檬酸作为碳源，对y p g a 的合成进行研究，结果显示丑s u b t i l i sa t c c 9 9 4 5 a 在谷氨 6 华中农业大学硕士学位论文2 0 0 6 酸培养基上若不另加碳源，将产生少量的t p g a ，添加带有标记的柠檬酸产生大量的 带有”c 标记的7 一p g a ，说明组成y p g a 单位的谷氨酸主要由柠檬酸和硫酸铵产生的， 也证明了谷氨酸、柠檬酸作为碳源参与? - p g a 的代谢是通过独立的途径形成共同的 单体即前体进行的，并没有通过碳源分解代谢和合成代谢的多重循环来实现 ( c r o m w i c k 。1 9 9 5 a ) 。 2 3 3 生产工艺 到目前为止丫- p g a 的发酵生产仍处于实验室阶段，小试生产方法归纳起来主要 有分批发酵法、固体发酵法、液体两相发酵法、连续发酵法等几种。分批补料发酵 法简单方便，容易控制和操作，因此研究的比较深入，使用得最为广泛( k oa n dg r o s s ， 1 9 9 8 ；y o o ne ta l , 2 0 0 0 ；k t m i o k aa n dg o t o ，1 9 9 4 ) 。 y p g a 的合成、分子质量、y p g a 分子中d - g l u 与l - g l u 的组成与培养基的配 方关系密切，目前对培养基的研究主要集中在碳源、氮源和金属离子的组成及对y p g a 的影响上。发酵一般采用p h 中性，培养温度3 0 3 7 c 。y p g a 产生菌需要大 量的碳源和氮源，大约是y p g a 产量的2 2 0 倍( k u n i o k a ，1 9 9 7 b ) 。碳源主要有葡 萄糖、蔗糖、谷氨酸、柠檬酸、甘油等，碳源的种类、浓度和不同碳源的比例对聚 一y 一谷氨酸的产量影响很大。葡萄糖比甘油更利于b 1 i c h e n i f o r m i s a t c c 9 9 4 5 a 的 生长( k o 和g r o s s ，1 9 9 8 ) 。y p g a 发酵所用氮源一般为无机氮源，如氯化氨等， 利用有机氮源时副产物的生成量较大。对b 1 i c h e n i f o r m i sw h b 3 ，柠檬酸和甘油 是最佳碳源( 杨革等，2 0 0 2 ) 。y - p g a 的聚合度和d l 构型比率都与金属离子的浓度 有密切关系，低浓度的m n “( 1 5 4 x l 旷) 更易促进在l 一谷氨酸溶液中的枯草芽胞杆 菌的生长，而提高m n ”浓度则会使菌体生长受到抑制，但y - p g a 的产量可得到提高 ( c r o m w i c k 等，1 9 9 5 ) 。同样c a 2 + 在培养基中的存在也有利于y - p g a 的合成，它的 浓度影响着细胞的活性，m o “也影响y p g a 的合成( 杨革等，2 0 0 1 ) 。 在实际发酵生产过程中，p h 值、通气和搅拌对7 - p g a 的产量有很大影响，尤其 是后两者是氧传递速率的主要影响因素，溶解氧的提高对生物量和产量均有显著的 提高作用。通入纯氧或高含氧的空气也是改善氧传递效率的方法。h o 等( 2 0 0 1 ) 在 3 7 c 、p h 值6 5 、通入纯氧和空气的混合气并保持氧压力在3 0 饱和度以上的条 件下发酵培养2 4h ，可得到高产量的y - p g a 发酵液。 目前，已有较多的利用工农业废料进行固体发酵的报道( k a t s i f a se ta l , 2 0 0 4 ： 华中农业大学顽上学位论文2 0 0 6 s e l v a k u m a r ，1 9 9 8 ) ，但是y p g a 的固态发酵研究的还不是很多。本实验室率先进 行了y p g a 的固体发酵技术的研究，专利菌株枯草芽胞菌c c t c c 2 0 2 0 4 8 的固态发 酵y - p g a 产量可达8 3 6 1g k g ( x u ，2 0 0 5 ) 。沙长清等( 2 0 0 4 ) 用丑s u b t i l i s n a t t o h w - 1 进行固态发酵，其7 - p g a 产量为1 1 5 9 k g 大豆。畜牧业废料为主要进行7 - p g a 的发酵也取得较好效果，2 5 猪粪和黄豆饼粉、麸皮在2 5 0 m l 摇瓶中发酵产量为6 ， 以奶牛粪尿为主要原料进行的7 - p g a 发酵产量为4 ，7 ( c h e n ，2 0 0 5 ；x i o n g ，2 0 0 5 ) 。 2 3 4 分离与纯化 高粘度发酵液中y _ p g a 的提取工艺主要有三种：有机溶剂沉淀法、硫酸铜沉淀 法和膜分离法。膜分离法步骤是在离心之前调节p h 值为3 可以大大降低发酵液的 粘度，然后将上清液p h 值调为5 ，用中空纤维膜进行超滤浓缩，浓缩液用乙醇沉淀。 37 - p g a 的应用 ， 7 - p g a 是一种天然的水溶性的聚合氨基酸，具有生物可降解性，对人体和环境 无毒害。近年来国内外对7 - p g a 及其衍生物在农业、食品、化工、材料、药物等领 域进行了大量应用探索，结果表明7 - p g a 是一种极具开发价值和前景的多功能新型 生物制品。 3 1 在农林园艺中的应用 王传海等( 2 0 0 4 ) 研究表明，7 - p o a 的最大自然吸水倍数可达到1 】0 8 4 倍，显 著高于目前市售的聚丙烯酸盐类吸水树脂，对土壤水分的吸收倍数为3 0 一8 0 倍； y - p g a 的水浸液在土壤中有一定的保水力和较理想的释放效果，有明显的抗旱促苗 效应7 - p g a 可明显提高小麦和黑麦草的发芽率，用其直接拌种也能提高种子的发芽 率。 y p g a 的保水特性也被用于苗木移栽、无土栽培等方面有良好效果，可望在改 造荒山、秃岭、沙漠方面发挥积极作用( g o n z a l e se la l ，1 9 9 6 ) 。原敏夫等科研人员 把纳豆树脂与胶状污泥、家畜粪尿制成混合肥料，用于包裹种子，将包裹着混合肥 料的种子团种在干旱的地里，纳豆树脂就会把周围水分吸过来，从而保证种子发芽、 出土、生长、存活。 陈雄( 2 0 0 5 ) ，以猪粪、奶牛粪为主要原料进行堆肥实验，获得了较好的7 - p g a 产量，为一定程度上解决畜牧业的粪便污染问题提供了一条途径，可以提高肥料的 华中农业大学硕士学位论文2 0 0 6 利用率，且t p g a 具有保水作用，这种特性使得7 - p g a 在农牧上的意义更大。 3 2 在环保领域的应用 目前，广泛使用的絮凝剂是聚合铝( 铁) 等无机高分子絮凝剂和聚丙烯酰胺等 合成有机高分子絮凝剂。这些絮凝剂有一些共同的缺点：对人和环境具有很大的毒 性甚至具有致癌性，且在自然环境中降解困难等。因此，发展绿色絮凝剂是絮凝齐j 行业发展的必然趋势，与此同时，生物絮凝剂以其安全、高效、节能和无二次污染 等使得其成为绿色絮凝剂中的杰出代表。r p g a 具有水溶性聚羧酸的性质，且显示 出很高的絮凝活性( y o k o ie ta l ，1 9 9 5 ；y o k o ie ta l ，1 9 9 6 ；s h i he ta l ，2 0 0 1 ；m a k o t o ， e ta l , 2 0 0 5 a , b ) 。可以预见，7 - p g a 用作絮凝剂不仅用在水处理领域，还可用于饮用 水处理、食品、发酵工业等。 重金属和放射性核在环境的大量积累会危害公众健康，利用生化过程治理重金 属和放射性核污染的研究正日益展开。通过微生物制备的生物高分子可与金属和放 射性核结合而起固定化作用。7 - p g a 对水中的c u 2 + 、a i ”、c ，、f e 3 + 等有较强的亲 和性，可用于除去废水中的重金属离子，因此可作为重金属或放射性物质的螯合剂， 用于回收金属和减少环境污染等( m c l e a ne t a l ，1 9 9 0 ；m c l e a ne ta t , 1 9 9 2 ) 。 3 3 在食品领域的应用 7 - p g a 安全可以食用，可广泛使用在食品领域。利用r p g a 可以增加溶液粘度 的性质，可以作为食品增稠剂和稳定剂；7 - p g a 分子上含有大量亲水基团，因而具 有良好的吸水保湿性能，日本将它用于淀粉类食品( 糕点、面条 中，防止老化，增 强质地和维持食品外形，延长货架期；聚谷氨酸可以增加面包的弹性，使面包，蛋 糕的颗粒更加细致，聚谷氨酸还可以增强面条的韧性，防止面条中的固体物质溶解 在沸水中( k o n n o ，1 9 8 9 ) 。 分子量低于2 0 万的聚谷氨酸具有比目前公认的具有高抗冻活性的葡萄糖更好 的抗冻性，因此聚谷氨酸的抗冻性和可食用性使聚谷氨酸可被广泛的应用于食品加 工领域和对深度冷冻敏感的酶或培养物的冷冻保藏( m i t s u i k z im e ta l ，1 9 9 8 ；施庆 珊等，2 0 0 4 ；游庆红等，2 0 0 2 ；何小兵等，2 0 0 3 ) 。而且y p g a 比通常的低分子量 防冻剂( 如糖类无机盐和蛋白质等) 味淡，食品中加入大量了7 - p g a 后对口感影响不 大。 9 华中农业大学硕士学位论文2 0 0 6 利用其会属螫合能力，聚一y 一谷氨酸还可以作为矿质吸收促进剂，在高矿物质 食品中加入了7 - p g a 或其降解产物可以促进小肠对矿物质的吸收，与酪蛋白磷酸肽 ( c p p ) 相比，它具有优良的水溶性，效果更佳；而且聚一y 一谷氨酸可以掩盖高浓 度矿质元素所带来的刺激性、收敛性和粗糙感等适口性问题，尤其适用于补钙和补 铁的保健品。( t a n i m o t oe t a l 1 9 9 5 ；t a n i m o t oe t a l , 2 0 0 1 ) 3 4 在饲料中的应用 y p g a 作为矿物营养促进剂在饲料中添加研究不多。t a n i m o t o 等( 1 9 9 8 a ) 研 究表明，聚一y 一谷氨酸( y p g a ) 可以添加于家畜、家禽、鱼、宠物的饲料中， 提高饲料中的矿物质吸收率，降低饲料中矿物质添加量，增强蛋壳强度和减少动物 体内脂肪积累。y p g a 还可以增加动物对磷的消化吸收，从而降低代谢物中磷的含 量，减低饲料成本，减少环境污染( k a r a s a w ae ta l ，1 9 9 8 ) 。y p g a 还可添加于猪 饲料中，促进猪的生长，提高瘦肉的产量( t a n i m o t oe t a l ，2 0 0 0 ) 。 3 s 在医药及工业上的应用 可以作为药物载体。y p g a 具有良好的生物亲和性和生物降解性，作为药物载 体可提供药物缓释性、靶向性，提高药物水溶性，降低药物不良反应，从而提高药 物疗效( 彭银仙等，2 0 0 2 ) 。作为生物可降解材料。丫- p g a 可以用来制作外科手术用 的粘胶剂、止血剂及密封剂和免拆手术缝合线等。如o t a n i 等( 1 9 9 8 ) 以7 - p g a 为 材料制作速效生物胶，是一种生物安全胶。t p g a 也可作为修复性医用高分子的主 要成分，用于制造人工眼角膜，人工骨头，高分子绷带的材料，超强吸水药棉等( 戈 进念，2 0 0 2 ) 。 主要成分为y p g a 和从芦荟、羊苷菊属植物和绿茶中提取的植物素( h a s e b ek e ta 1 ) ，可以增加皮肤表面毗咯羧酸含量和增强皮肤的保湿效果，且不影响皮肤定量 平衡，并维持皮肤必要的润滑成分，且这种成分可以用于医药、化妆品、清洗液等 方面。y p g a 还可用作分散剂，如分散水介质中的矿物、分散化妆品中的色素、分 散清洁剂中的固体颗粒和用于造纸工艺中( k i n ge ta ，1 9 9 9 ) 。 1 0 华中农业大学硕士学位论文2 0 0 6 4 固态发酵 4 1 固态发酵概述 现代固态发酵工业主要研究对象是纯种培养与大规模产业化，以液体深层发酵 为主导。但许多现代生物制品固态发酵的产率比液态深层发酵高的多。这是因为， 液态深层发酵产生的大量发酵废水、通气与机械搅拌的高动力能耗，成为液体深层 发酵进一步发展的障碍，迫使其向高浓度、高粘度方向发展，然而高浓度、高粘度 的极限就是固态发酵。 所谓固态发酵( 固态发酵，s o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o n ，s s f ) ，传统上是指在缺乏自 由水的固体颗粒组成的基质上进行微生物培养和发酵的技术。( l o n o s a n e ，1 9 8 5 ) 。 根据h e l l e t t i n e 和c a n n e l 等的定义，固态发酵是指在没有自由水( 或游离水) 的存 在下，微生物在固态底物上生长的过程，因此悬浮在液体中的固态颗粒或不溶性颗 粒的发酵不属于此范畴。固态发酵过程是需要水的存在的，但是这种水是因复合或 吸附的形式存在于基质的内部( 章克昌，1 9 9 5 ) 。对水的吸附能力是固态物料的一 种基本性质，不同物料不出现游离水时的吸水数量是不同的。对于大多数基质来说 水分在达到8 0 以前都将出现游离水。由于水分低于1 2 时所有的生物活性都停止 了，所以它也就是固态发酵进行的最低湿度( 章克昌，1 9 9 5 ) 。在曲的制备中，基 质的水分一般为3 5 一8 0 ，但最低的水分可以降至3 1 。本文探讨的固态发酵限于 以上所述的传统定义。 固态发酵工艺是很古老的技术，从远古时代人们就已利用固态发酵制造食品、 干酪和堆肥( 张礼星，1 9 9 9 ) 。虽然后来在工业开拓、改进提高及自动化进展方面只 在东方国家有所实施，但从世界范围看，此工艺依然无法和第二次世界大战后发展 起来的液体深层发酵法相比。 我国固态发酵技术已有几千年历史。我国传统白酒酿造过程中用作糖化剂和发 酵剂的酒曲，就是传统固态发酵技术的典型运用，其特点是多菌种、敞开式，现在 意义上的固态发酵还要设计特殊的反应器，其复杂性和机械化程度远优越于传统工 艺。 从表1 2 固态发酵看起来更加具有理论上的优势，实际上固态发酵因为发酵过 程的难以控制以及大规模生产的限制使的它的应用发展远不及液态发酵来的快。近 些年来，由于能源危机与环境问题的日益严重，固态发酵技术再次引起人们的兴趣， 华中农业大学硕l ：学位论文2 0 0 6 固态发酵领域的研究出现了翻天覆地的变化。大量固态发酵的综述出现( a s h o k p a n d e y ，e ta 1 ，2 0 0 0 ：t r o b i n s o n ，e la l ，2 0 0 1 ；u d oh o “l k e r ，2 0 0 5 ；a a g h a v a r a o ，e la t , 2 0 0 3 ) 。固态发酵的反应器研究发展也很迅速，中国科学院过程工程研究所研制的 压力脉动固态发酵反应器是固态发酵技术现代化的重大转折与标志，而且还是对生 物反应工程四传一反理论的检验与推动。反应器方面的综述也很多( d a v i da ，2 0 0 0 ； t i m ，吖a ，2 0 0 3 ；a d u r a n d ，2 0 0 3 ) 。 4 2 固态发酵的微生物资源 细菌、酵母、真菌都能够在固体基质上生长( 表1 3 ) 。丝状真菌是最适合在固 态发酵的也是研究的最多的。细菌主要用在堆肥、青贮和食品加工方面( d o e l l ee t 甜，1 9 9 2 ) 。酵母一般用在乙醇发酵、食品以及饲料的生产中( s a u c e d o c a s t a f i e d ae t a 1 ，1 9 9 2 a ，1 9 9 2 b ) 。 表1 2 固态发酵与液态发酵优缺点对比表格 t a b l e1 2c o m p a r i s o nb e t w e e nl i q u i da n ds o l i ds u b s t r a t e f e r m e n t a t i o n a 固态发酵液态发酵 培养基中没有游离水流动，水是培养基中 较低的组分水活度低限制了应用范围， 也限制了杂菌生长 微生物从湿的同态基质吸收营养物，营养 物浓度存在梯度 微生物所需氧主要来自气相，只需少量无 菌空气能耗低，通气压力低 代谢热驱除比较困难 发酵不均匀，菌体生长、营养吸收和代谢 产物分泌都不均匀 缺乏有效在线测量手段，过程控制较困难 发酵规模大，能耗大 培养基中始终有游离水的流动，水是培养 基中主要组分。水活度适应于大多数微生物 的生长 微生物从溶解水中吸收营养物营养物浓 度始终不存在梯度 微生物所需氧来自于溶解氧，能耗大需要 较高的气源压力 代谢热容易控制 发酵均匀 成熟的在线传感器，过程控制容易 难以进行大规模生产，能耗低 4 3 无菌操作相对概念 在液体发酵中，大多都要求无菌操作，因为杂菌可以在含水量高的液体培养基 1 2 华中农业丈学硕士学位论文2 0 0 6 中比发酵使用的微生物生长更好。 而对于固态发酵来说，其优势菌种一般可在含水量相对较低的情况下快速生长： 如果固态发酵所用微生物接种到已经灭菌的底物上，此过程使微生物优于杂菌生 表1 3 在固态发酵中得到应用的微生物举例 t a b l e1 3e x a m p l e so fm i c r o o r g a n i s m si n v o l v e di ns s f p r o c e s s e s 微生物种类 固态发酵中的应用 细菌 b a c i l l u ss p p s e u d o m o n a ss p l a c f o b a c i l l u ss p c l o s e d f i u ms p 酵母 s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e s c h w a n n i o m y c e sc a s t e 真菌 a s p e r g i l l u ss p f u s a f i u ms p m u c o r s d r h i z o p u ss p p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m b e a u v e f i as p m e t h a r i z i u ms p a s p e r g i l l u so o , - z a e r h i z o p u so l i g o s p o r u s a s p e r g i l l u sn i g e r p e n i c i l i u mn o t a t u m , r o q u e f o r t i i 堆肥、纳豆，淀粉酶 堆肥 青贮，食品 青贮，食品 食品，乙醇 乙醇、淀粉酶 堆肥、食品 堆肥、赤霉素 堆肥，食品、酶 堆肥、食品、酶、有机酸 堆肥、木质索降解 生物防治、生物杀虫剂 日本酒曲、食品、柠檬酸 印尼豆豉、淀粉酶、脂肪酶 饲料、蛋白、淀粉酶、柠檬酸 青霉素、奶酪 长，甚至可以排除杂菌的干扰。这意味着严格的无菌操作在固态发酵中不是十分重 要。当然，操作尽可能地无菌。与液体发酵相比，这种生化反应器设计要求低，相 华中农业大学硕士学位论文2 0 0 6 对费用也低，这些可能是固态发酵倍受青睐的重要原因。然而，也有一些产品在固 态发酵其微生物生长缓慢，易受杂菌污染，例如利用赤霉素生产赤霉酸。对于此种 情况，用一个可以在无菌条件下操作的生物反应器是十分必要的。这种固态发酵反 应器费用有可能与液体发酵反应器的费用相当。只有固态发酵具有像高产品浓度、 低下游处理费用等具体优点时，这种发酵方式才可能被选用。对于易染菌微生物的 固态发酵可采取加大接种量和利用密闭反应器( 转鼓式、密闭盘式及圆柱式反应器) 等措施来控制染菌。 4 4 固态发酵应用 固态发酵作为一种古老的发酵技术，发展到现在已经在很多方面得到了应用。 除纤维素酶的生产外，固态发酵还广泛应用于生产酶制剂、生物杀虫剂、洛伐他汀 等抗生素、食品、有机酸、土壤改造、生物冶金、造纸等方面，利用工农业废料进 行固体发酵也有较多的报道( k a t s i f a s 占fa ，2 0 0 4 ；s e l v a k u m a rp fa 1 9 9 8 ；陈雄， 2 0 0 5 ) 。r a g h a v a r a oe la “2 0 0 3 ) 和m a u r i c e ( 2 0 0 4 ) 对固态发酵应用研究的生产菌种、 所用基质和生产的产品进行了综述。 5 径向基神经网络和遗传算法在培养基优化中的应用 p o w e l l ( 1 9 8 5 ) 提出了多变量插值的径向基( r a d i u sb a s i sf u n c t i o n r b f ) 方法。 b r o o m h e a d 和l o w e ( 1 9 8 8 ) 将r b f 应用于神经网络的设计，构成了r b f 神经网络。 r b f 神经网络是一种典型的局部逼近神经网络，从结构上看，l 强f 神经网络是由输 入层、隐层、输出层构成的前向网络。径向基函数神经网络( r b f n n ) 由于其具有非 线性逼近能力强、网络结构简单、学习速度快等优点。 遗传算法是模仿自然界中生物群体的选择、杂交、变异等行为而发展起来的一 种优化算法，它是建立在自然选择和自然遗传学机理基础上的迭代自适应概率性搜 索算法，并找出最优解，由于遗传算法的随机特性，所有解都有被搜索的可能，因 而可以找到全局最优解。遗传算法的一般过程可以分为初始化、选择、交叉和突然 变异一个组成部分。f r e y e r ( 1 9 9 2 ) 等首先将其用于培养基的优化。方柏t h ( 2 0 0 0 ) 等运 用遗传算法在研究莫格假丝酵母利用木糖生产木糖醇时进行了6 个组分5 0 个浓度水 平的培养基优化。进行了4 代共8 0 瓶摇瓶实验，以较少的实验次数在较大搜索区域 内，完成培养基优化。按照优化后的培养基组成，由5 0 0 9 l 木糖获得j 2 9 7 9 l 木糖 1 4 华中农业大学硕士学位论文2 0 0 6 醇，比优化f i i 提高5 7 。 采用遗传算法或者神经网络进行培养基优化的文章已经有所报道( 李绍新等， 2 0 0 4 ；卫功元等，2 0 0 3 ；马雷等，2 0 0 3 ：方柏山等，2 0 0 0 ；蔡字杰等，2 0 0 1 ) 6 本研究的目的意义 y p g a 作为一种可降解材料，已经在医药化工、食品、饲料、园艺农林中有应 用。随着化工合成材料对环境造成的白色污染的日益加重和人们环保意识的加强， 生物可降解材料y p g a 更是成为目前研究的热点之一。鉴于固态发酵的优点，在 农林、园艺和畜牧领域应用低成本的固态发酵y p g a 的研究也变得更有意义。本 研究采用本实验室自主分离的一株新的产y p g a 菌株枯草芽胞菌m e 7 1 4 为研究对 象，以提高r p g a 的固态发酵产量为目的，对发酵培养条件和固体基质的种类， 用量，外加碳氮源等营养条件进行优化。同时初步研究了此菌株的固态发酵扩大培 养的载体添加，及添加后的发酵条件。并且以昆明小鼠为材料初步评价了添加y p g a 的固态发酵产物的混合饲料对不同生长期的小白鼠生长的影响。 华中农业大学硕 二学位论文2 0 0 6 第二章枯草芽胞杆菌m e 7 1 4 的固态发酵培养基优化 1 目i j 吾 y p g a 发酵水平的提高，主要依赖于菌种选育、培养基和培养条件的优化。 菌种选育就是按照生产要求，根据微生物的遗传和变异的理论，用人工的方法造成 菌种变异，再经过筛选获得高产菌株扶而达到提高发酵水平的目的(