电泳操作方法.doc

XXX有限公司SDS-PAGE 电泳的测定方法文件编号XXXX-02制定部门研发部版本A/0页码1/3生效日期2014/4/9一、 目的建立SDS-PAGE电泳的测定方法,确保电泳检测的准确性，保证电泳的安全性、有效性。二、 范围与权责适用于本公司的所有成品以及中间体的分析，由化验员负责采样检测。品控主管负责审核。三、 原理SDS-PAGE电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS,SDS会与变性的多肽结合，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：lgMw=k-bX。式中：Mw为分子量；X为迁移率；k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对数分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。四、 实验仪器及试剂1. DYCZ-24DN 双垂直电泳仪2. DYY-8C 电泳仪电源3. STS-2A 脱色摇床（水平）4. 标准蛋白Marker5. 平皿：直径150mm6. TEMED:四甲基乙二胺7. DTT:二硫苏糖醇8. 储存液2M Tris-HCl缓冲液：称取24.2g Tris，用50ml蒸馏水溶解后，滴加HCl调节pH至8.8，待室温，加蒸馏水至100ml。1 M Tris-HCl缓冲液：称取12.1g Tris，用50ml蒸馏水溶解后，滴加HCl调节pH至6.8，待室温，加蒸馏水至100ml。10%SDS溶液：称取10g SDS ，加蒸馏水溶解至100ml。50%甘油：50ml甘油加50ml蒸馏水，混合均匀。1%溴酚蓝：100mg溴酚蓝，加蒸馏水至10ml，搅拌至完全溶解，水相针式过滤器过滤除去聚合的染料。9. 工作液A液：30%丙烯酰胺储存液，丙烯酰胺是一种神经毒素，可通过皮肤被人体吸收并富集。操作时要避免皮肤接触，并带合适的口罩于通风橱中进行。B液分离胶缓冲液：取75ml 2M Tris-HCl缓冲液，4ml10%SDS溶液，加21ml蒸馏水，混合均匀，4保存数月。C液浓缩胶缓冲液：取50ml 1M Tris-HCl缓冲液，4ml10%SDS溶液，加46ml蒸馏水，混合均匀，4保存数月。10%APS：称取1g过硫酸铵，加10ml蒸馏水溶解后，水相针式过滤器过滤分装到EP管中，XXXX有限公司SDS-PAGE 电泳的测定方法文件编号XXXX-02制定部门研发部版本A/0页码2/3生效日期2014/4/94保存一个月，-20摄氏度保存一年。上样缓冲液：称取0.154g DTT，于10ml容量瓶中，加少量水溶解后，加 0.6ml 1 M Tris-HCl缓冲液，5ml 50%的甘油，1ml 1%溴酚蓝，混合均匀后定容至刻度线。可分装至EP管保存，4保存一个月，-20摄氏度保存一年。电极缓冲液：称取3g Tris，14.4g Gly，1g SDS至1L烧杯中，加1L蒸馏水溶解，搅拌均匀，室温保存。10. 染色液：称取1g考马斯亮蓝R-250，加450ml乙醇，加100ml乙酸，加水450ml，混合均匀，室温保存。11. 脱色液：100ml乙醇，加100ml冰醋酸，加水800ml，混合均匀，室温保存。五、 操作步骤1、电泳仪的组装 将平板玻璃和凹板玻璃重叠，用手将两块玻璃板在桌面上或是玻璃板上竖起，使两玻璃底面平齐，从而形成胶室。 将胶室放入主体，是凹玻璃的一面向内。若做单面胶，另一侧用单胶堵板（=5mm）代替。 插入楔形插板，用力向下按，挤紧玻璃板。 将主体放入原位制胶器内，手柄起立位与底座箭头对齐，两手同时把手柄向主体推动，直到推不动为止，然后开始旋转手柄，听到咔、咔两声，底座箭头指向手柄1.0mm标志处，此时楔形插板已压紧胶室，可以开始灌胶了。2、分离胶的配制12%分离胶（10ml）A液B液蒸馏水10%APSTEMED4ml2.5ml3.5ml50l5l按上表，将A液，B液，蒸馏水先加到小烧杯中，混合均匀，再添加10%APS,TEMED后，混合均匀，迅速连续地灌到两玻板间隙中去，留出灌注浓缩胶的空间（齿长再加0.5cm），用移液枪小心加蒸馏水覆盖，直至有蒸馏水溢出，在室温或恒温箱内垂直放置30min，使其完全聚合凝固，在凝胶面与水封层之间可见清晰的分界线。 倾出蒸馏水，用滤纸条小心地吸取分离胶顶部残留的水。3、浓缩胶的配制5%分离胶A液C液蒸馏水10%APSTEMED680l1ml2ml30l6l按上表，将A液，C液，蒸馏水先加到小烧杯中，混合均匀，再添加10%APS,TEMED后，混合均匀，迅速连续灌到分离胶顶部，直至有胶溢出，随即插入试样格，在室温或恒温箱内垂直放置10min，静置直至完全聚合。4、样品的处理 将样品与上样缓冲液以4：1混合均匀，在金属浴上100，10min，如有沉淀，可适当离心备用。5、加样 在凝胶聚合后，向相反的方向拧手柄，手柄弹出。 将电泳仪主体从原位制胶器上取出放入电泳仪下槽中。 将约140ml的电泳缓冲液倒入由胶室和主体形成的上槽中，使缓冲液没过凹玻璃板。XXXX有限公司SDS-PAGE 电泳的测定方法文件编号XXXX-02制定部门研发部版本A/0页码3/3生效日期2014/4/9将约200ml的电泳缓冲液倒入下槽中慢慢地将试样格垂直拔出。将处理好的标准蛋白和待测蛋白样品，按预定顺序通过缓冲液小心的添加510l到每个样品孔中。6、电泳盖好电泳槽盖，接通电泳仪电源与电泳仪之间的电泳导线，设定电压为60V，电泳时间约为30min，直至溴酚蓝指示带经过浓缩胶与分离胶的分界线后，设定电压100v，电泳时间150min，直至溴酚蓝指示带接近分离胶底部，切断电源，电泳完毕。7、剥胶 卸下电泳胶板，用刮刀小心撬开玻璃板，使两者分离，切除凝胶左下角以示标记。8、染色从玻璃板上，将凝胶小心的整块刮到装有染色液的平皿中，置于摇床上染色45r/min，1h。9、脱色从染色液中小心取出凝胶，注意不要弄破，用蒸馏水清洗几次，转移到装有脱色液的平皿中，置于摇床上脱色45r/min，根据脱色情况更换脱色液，脱色过夜。 脱色后，可将凝胶拍照保存，或是将凝胶浸于水中保存一段时间。10、绘制标准曲线 测量染料和蛋白质区带移动的距离，即从分离胶电泳起始至染料区带孔洞及蛋白质区带中心位置的距离。11、标准曲线的制作 纵轴为标准蛋白质相对分子质量的对数，横轴为对应的迁移率，可得标准工作曲线，即可根据迁移率测出未知蛋白的分子量。六、