_氨基丁酸测定方法的研究.pdf

2 0 0 7年第0 5期 V o l 2 8 N o 0 5 2 0 0 7 食品工业科技 近年来 G A B A在食品中的应用研究正在掀起 而食品中G A B A的测定方法的报道尚不多见 由于 G A B A对电化学和紫外 可见光的不灵敏性 导致用 直接方法对它进行测定比较困难 关于G A B A的测 定近年来国内外有氨基酸分析仪测定 酶法 1 色质 联用法 柱层析荧光测定法 纸电泳比色 毛细管气 相色谱法 2 放射性受体法 3 毛细管电泳法 4 以及高 效液相色谱法 5 6 等 这些方法大多用于医学领域 且 价格昂贵 不适用于大量的定量分析 在进行高产 G A B A乳酸菌株的筛选中 以及菌株发酵条件优化 中 都要进行大量的G A B A定量分析 显然需要一种 简便 价廉的定量测定方法 因此本文研究了纸层析 法 7 1 3 定量测定 G A B A的方法 在需要精确测定 G A B A时 本文研究了P I T C柱前衍生 紫外检测 G A B A的H P L C法 8 1材料与方法 1 1材料与仪器 乳酸菌发酵液实验室筛选乳酸菌发酵后所得 G A B A L 谷氨酸 G l u 上海生化试剂公司 磷酸吡 哆醛 P L P 异硫氰酸苯酯S i g m a公司 乙腈 甲醇 乙醇 三乙胺均为色谱纯 冰醋酸 磷酸氢二钠为 分析纯 长沙市天恒科学仪器设备有限公司 7 2 2型分光光度计上海精密科学仪器公司 S B 5 2 0超声波清洗机上海新芝生物技术研究所 津腾隔膜真空泵型号G M 0 3 3 天津市腾达过滤 器件厂 v a r i a n高效液相色谱仪 艾科浦U系列超纯 水机 层析缸 1 2实验方法 1 2 1样品处理 1 2 1 1测定乳酸菌发酵液中G A B A含量将发酵2 d 的T Y G液体发酵培养基取1 0 m L煮沸后 1 2 0 0 0 r m i n 离心5 m i n后取上清液 先用纸层析法进行定性分析 然后分别用H P L C法 纸层析法和比色法测定G A B A 含量 1 2 1 2测定乳酸菌的谷氨酸脱羧酶 G A D 活性取 生长对数期乳酸菌的G A D粗酶液 9 加入p H 5 6 含 有1 G l u的底物溶液 4 0 反应1 h 将反应液于沸 水中煮沸5 m i n 1 2 0 0 0 r m i n离心分离5 m i n 取上清液 分别用H P L C法 纸层析法和比色法测定反应生成 的G A B A量 1 2 2发酵液中G A B A初步定性分析纸层析法 新 华一号层析纸 展开相为正丁醇 冰醋酸 水 4 1 3 展开后自然晾干溶剂 展开剂中加入0 4 茚三酮 8 5 显色1 5 m i n G A B A和L 谷氨酸分别配成5 m g m L作 定性参比 发酵液与标样均点样0 2 L 1 2 3H P L C法测定G A B A 1 0 1 1 1 2 3 1样品处理同1 2 1 1 2 3 2样品测定取上清液1 0 m L置4 下保存 氨基丁酸测定方法的研究 陈海军 1 林亲录 2 王 婧 1 李丽辉 1 1 湖南农业大学食品科学与技术学院 湖南长沙4 1 0 1 2 8 2 中南林业科技大学食品科学与工程学院 湖南长沙4 1 0 0 0 4 摘要 在用乳酸菌发酵生产 氨基丁酸 a m i n o b u t y r i c a c i d G A B A 时 为了对发酵液中的G A B A进行定性与定量分 析 本文对纸层析法 高效液相色普法 H P L C 进行了研 究 结果发现用本文中实验所确定的改良纸层析法进行 初步的定性与定量分析是可行的 再配合P I T C柱前衍 生 紫外检测的H P L C法进行精确定量分析 结果准确 重复性好 关键词 G A B A 纸层析法 高效液相色普法 A b s t r a c t I nt h i sp a p e r p a p e rc h r o ma t o g r a p h yme t h o da n d h i g hp r e s s u r el i q u i dc h r o ma t o g r a p h yw e r es t u d i e d o nq u a l i t a t i v ea n a l y s i sa n dq u a n t i t a t i v et e c h n i q u eo f G A B Aw h i c hf e r me n t e db yl a c t o b a c i l l u s A sar e s u l t t h e i mp r o v e me n tp a p e rc h r o ma t o g r a p h y me t h o d w h i c he x p e r i me n t e di nt h i st e x t ma k es u r et oc a r r y o n t h e f i s t s t e p i n q u a l i t a t i v e a n a l y s i s a n d q u a n t i t a t i v ea n a l y s i sa r e v i a b l e T h e n ma t c h t h e P I T Cp i l l a r d e v e l o p e db e f o r e t h eH P L Cme t h o do f t h eu l t r a v i o l e te x a mi n a t i o nc a r r i e do nt h ea c c u r a t e q u a n t i t a t i v ea n a l y s i s r e s u l ti sa c c u r a t e w i t hh i g h r e p r o d u c i b i l i t y K e y w o r d s a mi n o b u t y r i c a c i d p a p e rc h r o ma t o g r a p h y me t h o d h i g hp r e s s u r el i q u i dc h r o ma t o g r a p h y 中图分类号 T S 2 0 1 2文献标识码 A 文 章 编 号 1 0 0 2 0 3 0 6 2 0 0 7 0 5 0 2 3 5 0 4 收稿日期 2 0 0 6 1 0 3 0 作者简介 陈海军 1 9 8 1 男 在读硕士 研究方向 食品生物技术 分 析 检 测 2 3 5 S c i e n c ea n dT e c h n o l o g yo fF o o dI n d u s t r y 2 0 0 7年第0 5期 食品工业科技 H P L C法测定G A B A含量 1 2 3 3色谱条件色谱柱 v e n s u i l B P A A氨基酸专 用柱5 m 1 0 0 4 6 2 5 0 m m 流动相 流动相A为乙 腈 7 0m m o L L 1醋酸缓冲液 p H6 5 2 5 9 7 5 流动 相B为乙腈 水 甲醇 4 5 0 4 0 0 1 5 0 洗脱条件 流动相 A 流动相B 5 0 5 0 流速1 0 m L m i n 洗脱时间 2 0 m i n 紫外检测波长2 5 4 n m 柱温4 0 进样量 1 0 L 1 2 3 4溶液配制样品稀释液 5 m o L L的N a 2H P O4 缓冲溶液 p H 7 4 样品干燥液 甲醇 1 0 m o L L醋酸钠 三乙胺 2 2 1 v v v 衍生化试剂 异硫氰酸苯酯 P I T C 甲醇 乙醇 三乙胺 水 1 6 1 1 1 v v v v v 需 新鲜配制 1 2 3 5样品衍生化取超滤液2 0 L注入0 5 c m 5 c m的玻璃试管中 冷冻干燥 然后加入干燥液 1 0 L 再一次冻干 再加入2 0 L衍生化试剂 室温 衍生2 0 m i n后经冻干置冰箱4 保存 5 0 L样品稀 释液复溶 1 0 L或2 0 L进样 1 2 4纸层析法测定G A B A 1 2 4 1样品处理同1 2 1 1 2 4 2样品测定吸取1 0 L的G A B A样品 点样 线距滤纸2 0 c m 样品间距2 0 c m 将点样后的滤纸 条在展开剂中展开 风干显色 将与标准品位置一致 的斑点剪下 用0 1 硫酸铜 7 5 乙醇 2 3 8的洗脱 液洗脱 5 2 0 n m处比色测定 2结果与讨论 2 1 H P L C法测定G A B A G A B A的P I T C衍生物进行紫外扫描 1 2 在2 5 4 n m 处有最大吸收波长 G A B A标样和乳酸菌发酵液经 P I T C柱前衍生后在2 5 4 n m的图谱分别见下图1 图2 从图1 图2可以看出 在本文所确定的实验方 法下G A B A标样出峰时间短 G A B A的保留时间为 6 2 4 1 m i n 峰型好 乳酸菌发酵液中的G A B A与其它 物质分离效果好 2 1 1 H P L C法测定G A B A的标准曲线制作配制不 同浓度的G A B A溶液 各取1 0 L进样 上柱分离检 测后 以G A B A浓度对标准峰面积绘制标准曲线 如 图3所示 由图3可以看出 G A B A的P I T C柱前衍生H P L C 法检测G A B A时线性关系良好 可以作为G A B A的 精确定量分析方法 2 1 2精密度测定 取同一份经衍生处理后的样液 分 多次进样 每次进样1 0 L 测得R S D为1 2 n 5 2 1 3回收率测定取已知浓度的G A B A标样衍生 液适量 分别加入原含有不同已知G A B A量的样品 衍生液中 取1 0 L进样测定 计算回收率 结果为 1 0 1 4 2 2定量纸层析法测G A B A 2 2 1展开剂和显色剂浓度选择关于纸层析法定量 测定氨基酸 不同文献使用了不同的展开剂和配比 但没有专门分离G A B A的报道 本文选择了几种展 开剂配方 发现展开剂配方为正丁醇 醋酸 水 4 1 3 时 测A 5 2 0值 1 3 能够很好地将G A B A与其它氨基酸 分离 为了克服传统喷雾显色造成的重现性差 定量 不准确的缺点 本文改进了显色方法 将一定量的茚 三酮溶解于展开剂中 在展开过程中 茚三酮随着展 开剂沿滤纸向上移动 由于固定了显色剂的量 使测 定结果更准确 不同浓度的茚三酮显色 洗脱后比色 结果显示 0 4 的浓度较合适 见表1 2 2 2显色温度和时间的选择为了定量的准确性和 重现性 减少操作引起的误差 应将显色温度和洗脱 图1G A B A标样的H P L C图 3 0 2 5 2 0 1 5 1 0 51 01 5 图2样品中G A B A的H P L C图 1 0 0 7 5 5 0 2 5 0 51 01 5 图3G A B A浓度与峰面积的曲线图 1 0 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 00 20 40 6 y 2 E 0 6 x 5 3 1 5 6 R 2 0 9 9 9 5 峰面积 G A B A浓度 g m L 茚三酮浓度 A5 2 0 0 10 2 4 4 0 20 2 8 0 0 30 3 0 0 0 40 3 5 8 0 50 3 6 0 0 60 3 6 1 表1不同茚三酮浓度对A5 2 0的影响 分 析 检 测 2 3 6 2 0 0 7年第0 5期 V o l 2 8 N o 0 5 2 0 0 7 食品工业科技 时间确定下来 将点有G A B A标准品层析纸展开后 放入烘箱 在8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 分别显色1 0 2 0 3 0 4 0 m i n 剪下显色斑点洗脱比色 结果见表2 由表2可见 温度低于9 0 洗脱液的A 5 2 0偏 低 可能由于G A B A显色不完全所致 当温度高于 1 0 0 时 洗脱液的A5 2 0也偏低 可能是由于温度过 高 G A B A与茚三酮的反应物与层析纸结合牢固 不 能被洗脱下来 在洗脱液中形成铜的络合物 因此 选择显色温度和时间为9 0 1 0 m i n 2 2 3颜 色 稳 定 性 确 定由 图4可 知 茚 三 酮 和 G A B A反应物的洗脱液在放置超过1 h时 A5 2 0明显 下降 对结果造成较大偏差 洗脱液在1 0 5 0 m i n内 颜色较稳定 A 5 2 0值变化不明显 在这个时间范围内 可以采用茚三酮比色法定量测定G A B A含量 2 2 4测定范围的确定由图5可见 当点样量在 4 0 g以内时 洗脱液的A5 2 0与G A B A的量呈良好的 线性关系 可在此范围内绘制标准曲线 定量测定 G A B A含量 2 2 5标准曲线绘制配制不同浓度的G A B A溶液 各取1 0 L点样 层析后 洗脱比色 以G A B A浓度对 A5 2 0绘制标准曲线 如图6所示 由图6可见 G A B A含量与A 5 2 0之间呈高度相 关 其相关系数R 2 0 9 9 7 6 2 2 6回收率测定取1 0 L含G A B A样品点样 对 样品进行回收实验 结果见表3 由表3可见 纸层析法测定乳酸菌发酵液中的 G A B A R S D在1 0 3 1 3 2 之间 小于2 5 回收 率为9 5 3 1 0 1 7 2 2 7纸层析法与H P L C法比较分别用纸层析法和 H P L C法测定相同的含G A B A的乳酸菌发酵样品 结 果见表4 由表4可见 纸层析法精密度较高 测定结果比 H P L C法略偏低 但差异不大 而且纸层析法简便易 行 耗费低廉 适合用于大量样品的测定 只要在测 定过程中严格控制显色温度和时间 即可获得较为 准确的测定结果 因此 在乳酸菌G A D的分离纯化 过程中酶活性测定 测定产物G A B A 和高产G A B A 图4洗脱液放置时间与A5 2 0的关系 0 2 0 1 5 0 1 0 0 5 0 05 01 0 01 5 0 A5 2 0 时间 m i n 时间 m i n 温度 8 09 01 0 01 1 0 50 1 9 60 2 0 90 2 0 10 1 9 0 1 00 2 2 00 2 3 50 2 3 00 2 2 1 2 00 2 2 30 2 4 00 2 3 20 2 3 0 3 00 2 2 50 2 3 80 2 3 00 2 3 1 4 00 2 2 80 2 3 90 2 3 10 2 2 4 表2不同显色温度下洗脱液的A5 2 0值 样品测定值 m g m L 外标加入量 m g m L 加外标后测得量 m g m L 回收率 R S D 11 7 8 91 0 2 82 8 3 41 0 1 71 0 3 21 7 8 91 0 2 82 8 1 19 9 41 1 1 31 7 8 91 0 2 82 7 6 99 5 31 1 2 42 0 5 02 0 1 54 0 3 99 8 71 0 9 52 0 5 02 0 1 54 0 6 19 9 81 2 0 62 0 5 02 0 1 54 0 1 89 7 71 3 2 表3纸层析法测定乳酸菌发酵液中的G A B A 测定次数1234567891 0 纸层析法2 0 5 02 0 5 42 0 5 12 0 5 02 0 5 92 0 6 12 0 5 12 0 6 02 0 5 82 0 6 1 H P L C法 表4纸层析法和H P L C法比较 m g m L 图5G A B A点样量与A5 2 0值的变化关系 0 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 05 01 0 01 5 02 0 0 A5 2 0 点样量 g 图6G A B A标样的A5 2 0曲线图 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 00 246 A5 2 0 G A B A的浓度 m g m L y 0 1 2 2 x 0 0 0 5 R 2 0 9 9 7 6 2 1 7 1 下转第2 4 7页 分 析 检 测 2 3 7 2 0 0 7年第0 5期 V o l 2 8 N o 0 5 2 0 0 7 食品工业科技 乳 酸 菌 株 筛 选 过 程 中 发 酵 液 中 G A B A的测定方法都可以采用纸层析法 3小结 3 1研 究 了H P L C法 测 定 乳 酸 菌 发 酵 液 中 的 G A B A 此法检出限为5 m g L R S D为1 2 回收率 为1 0 1 4 3 2研 究 了 纸 层 析 法 测 定 乳 酸 菌 发 酵 液 中 的 G A B A 确定了展开剂的配方为正丁醇 醋酸 水 4 1 3 内 含0 4 的 茚 三 酮 显 色 温 度 和 时 间 为9 0 1 0 m i n 洗脱液在 1 0 5 0 m i n内颜色较稳定 测定范围 为8 4 0 g 相对标准偏差为0 7 9 R S D在1 0 3 1 3 2 之间 小于2 5 回收率为9 5 3 1 0 1 7 3 3分别用纸层析法和H P L C法测定相同的样品 发现纸层析法精密度较高 测定结果比H P L C法略 偏低 但差异不大 由于纸层析法简便易行 耗费低 廉 适合用于大量样品的测定 可以在酶的分离纯化 过程中作为酶活检测 测定产物G A B A 和 产G A B A 乳酸菌的分离筛选的过程中发酵液中G A B A的定量 测定方法 而H P L C法可以用于需要精确定量的样品 测定 在生产与科研中 两种方法结合使用可以大大 降低实验费用 参考文献 1 胡红焱 杨树德 细菌荧光法酶生物发光分析法测定血清 中 氨基丁酸 J 临床检验杂志 1 9 9 8 1 6 2 6 7 6 9 2 徐小平 脑内 氨基丁酸的毛细管气相色谱测定法 J 华 西药学杂志 1 9 9 0 5 2 1 0 7 1 0 9 3 N a h o r s k i S R Ar a d i o r e c e p t o r a s s a yu s i n g3 H m u s c i m o l f o r G A B Ai nH u m a nC S J FB r J P h a r m a c a l 1 9 8 1 7 2 1 6 1 8 4 朱珠 递质氨基酸的毛细管电泳 安培检测 J 分析测试学 报 1 9 9 9 1 8 4 3 6 3 8 5 L i n d r o t h P M o p p e r K H i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h yd e t e r m i n a t i o no f s u b p i c o m o l eo f a m i n oa c i d sb y f l u o r e s c e n c ed e r i v a t i z a t i o nw i t ho p h t h a l d i a l d e d y d e J A n n l C h e m 1 9 7 5 5 1 1 0 1 6 6 7 1 6 6 9 6 L i u H J D e t e r m i n a t i o n o fa m i n o a c i d sb y p r e c o l u m n d e r i v a t i z a t i o nw i t h6 a m i n o q u i n o l y l N h y d r o x y s u c c i n i o m i d y l c a r b a m a t ea n dh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yw i t h u l t r a v i o l e t d e t e c t i o n J J C h r o m a t o g r 1 9 9 4 6 7 0 1 5 9 6 2 7 宁正祥 食品成分分析手册 M 北京 中国轻工业出版社 2 0 0 1 1 0 6 1 0 9 8 T o j i r oT s u s h i d a T o s h i n o b uM u r a i C o v e r s i o no fg l u t a m i c a c i dt o a m i n o b u t y r i ca c i di nt e al e a v e su n d e ra n a e r o b i c c o n d i t i o n s J A g r i c B i o l C h e m 1 9 8 7 5 1 1 1 2 8 6 5 2 8 7 1 9 许建军 江波 许时婴 L a c t o c o c c u s l a c t i s谷氨酸脱羧酶的 分离纯化及部分酶学性质 J 无锡轻工大学学报 2 0 0 4 5 1 0 朱人敏 秦苏堤 何小平 等 高效液相色普法测定人胃黏膜 中 氨基丁酸和谷安酸含量 J 世界华人消化杂志 2 0 0 4 5 1 5 1 1 谭少云 余伟鸣 叶放 H P L C法测定脑复清胶囊中 氨 基丁酸的含量 J 中国新药杂志 2 0 0 2 1 1 1 1 1 2 黄量 于德泉 紫外光谱在有机化学中的应用 M 科学出 版社 1 3 张晖 徐永 姚惠源 纸层析法定量测定米胚芽中的 氨 基丁酸 J 无锡轻工大学学报 2 0 0 4 3 b o r a g i n a c e a e s p e c i e s J C h r o m a t o g r a p h i a 2 0 0 2 5 6 6 7 3 6 7 7 8 J LC u i l G u e r r e r o PC a p m p r a M a d r i d E l H a s s a nB e l a r b i L i n o l e n i c a c i dp u r i f i c a t i o nf r o ms e e do i l s o u r c e s b ya r g e n t a t e d s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y c o l u m n J P r o c e s s B i o c h e m i s t r y 2 0 0 0 3 6 3 4 1 3 5 4 9 C h e nTC YH 1 u A ni m p r o v e df r a c t i o n a l c r y s t a l l i z a t i o n m e t h o df o r t h e e n r i c h m e n t o f G L Ai nb o r a g eo i l f a t t ya c i d J I n d E n g C h e mR e s 2 0 0 0 4 0 3 7 8 1 3 7 8 2 1 0 G e r a l dPM c N e i l l C h r i s R a v l i n s A n n e CP e i l o w E n z y m a t i c e n r i c h m e n t o f c o n j u g a t e dl i n o l e i ca c i di s o m e r s a n di n c o r p o r a t i o n i n t o t r i g l y c e r i d e s J J A O C H 1 9 9 9 7 6 1 1 1 2 6 5 1 2 6 9 1 1 田强 刘丽丽 脲包法富集被孢霉菌丝油 亚麻酸工艺 条件的研究 J 天津师范大学学报 自然科学版 2 0 0 5 2 5 2 2 6 2 8 1 2 H a nX i j i a n g X uP i n g M e n gX i a n g l i P r e p a r a t i o no f H i g h P u r i t y L i n o l e n i c A c i d f r o mO i l o f L i t h o s p e r m u E r y t h r o r h i z o n b yU r e aI n c l u s i o na n dC o l u m nC h r o m a t o g r a