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miRNA概述miRNA概述 2011年10月16日精准的基因表达调控对生物体的生长发育和各项生理功能的执行至关重要。过去对基因表达调控的研究主要集中在转录因子介导的基因转录调控方面(激活或抑制基因转录)。而RNA一度被认为是DNA和蛋白质之间的过渡，但越来越多的证据清楚的表明RNA在生命的进程中扮演的角色远比先前设想的重要，晚近发现了一系列小分子非编码RNA (small noncoding RNA), 包括miRNA (microRNA), siRNA (small interfering RNA), piRNA (piwi-interacting RNA)和esiRNA (endoribonuclease-prepared siRNAs)等，小RNA的发现揭示了真核生物全新的基因表达调控方式，它们构成RNA调控网络，参与调控包括细胞增殖、分化和凋亡等进程(Httenhofer et al., 2005)。 miRNA是一类重要的内源性非编码小RNA分子，大约由21-25个核苷酸组成。miRNA通常靶向一个或多个mRNA，通过抑制翻译或降解靶标mRNA而调节基因的表达(Bartel et al., 2004, 2009)。miRNA在植物界和后生动物界间表现不同的特性。植物miRNA与其靶基因通过近乎完美互补的方式相结合；而在后生动物中，经常是一条miRNA和靶基因的多个位点相结合，或是一条miRNA调节多种靶基因。另外，后生生物miRNA靶点位于mRNA的3非翻译区(3 untranslated region, 3 UTR)，而植物miRNA靶位点可以位于3 UTR，更多情况下位于mRNA的编码区(coding region, open reading frame, ORF) (He et al., 2004)。人类基因组中约存在1000条miRNA，估计调节超过60%的哺乳动物基因(Lim et al., 2003; Bentwich et al., 2005; Friedman et al., 2009)。不同形式的细胞和组织类型miRNA表达水平不同，可能参与了各器官生理功能的执行过程(Lagos-Quintana et al., 2002; Brennecke et al., 2003; Chen et al., 2004; Poy et al., 2004; Cuellar et al., 2005; Harfe et al., 2005; Lim et al., 2005; Wilfred et al., 2007)；而且在多种病理状态下，miRNA呈现异常表达，在疾病发生、发展和转归中发挥了重要作用，使基于miRNA的治疗方式研究呈现美好前景(Trang et al., 2008; Li et al., 2009; Fasanaro et al., 2010)。 1. miRNA的发现 miRNA是由Victor Ambros, Rosalind C. Lee和Rhonda L. Feinbaum等人在研究lin-14基因调节线虫(C. elegans)发育中作用时发现的(Lee et al., 1993)。他们发现LIN-14蛋白丰度受到一个由lin-4编码的短RNA产物的调节，来自lin-4基因的61 nt前体生成一个22 nt的RNA，该RNA含有与lin-14 mRNA 3 UTR部分互补的序列，这种互补序列为抑制lin-14翻译生成LIN-14蛋白的充分必要元件。然而在当时，lin-4却被认为是线虫中特有的现象而被忽视，直到2000年，let-7被发现，let-7可以抑制发育转型调节基因的翻译，很快又发现let-7在多个物种间存在，表明在更广泛的物种中存在这种保守的调节形式(Pasquinelli et al., 2000; Reinhart et al., 2000; Tanzer et al., 2004; Lee et al., 2007; Molnar et al., 2007; Kren et al., 2009)。 2. miRNA的命名术语 当前已发展了一套标准的miRNA命名系统(Ambros et al., 2003; Griffiths-Jones et al., 2006)。前缀mir后紧跟“-”和相应数字，数字通常显示发现的先后次序。小写的mir-指miRNA前体(pre-miRNA)，大写的miR-则指成熟microRNA。对于差别只有一或两个核苷酸的miRNA，在命名时通常另外添加一个小写字母，例如miR-200a和miR-200b。为了区分物种来源，通常在miRNA前面加上代表物种来源字母组成的前缀，如人源的使用has，而绵羊(Ovis aries)来源的使用oar，v表示来自病毒基因组，D表示果蝇等。如果定位于不同基因组位置的miRNA前体生成完全一致的成熟miRNA，则通常使用“-”加数字后缀来区别这种情况，例如hsa-mir-194-1和hsa-mir-194-2位于基因组的不同位置，而剪切生成相同的成熟miRNA序列hsa-miR-194。当两个成熟miRNA来自于相同的miRNA前体相反的两个臂，则使用“-3p”和“-5p”后缀（曾使用s和as表示，即sense和antisense）。当相对表达水平已知时，通常使用星号表示该miRNA在表达水平上较其对应反向臂miRNA低，例如miR-31和miR-31*分别来自于同一前体miRNA的两对应臂，且miR-31为主要存在形式。 3. miRNA的生物起源 约一半miRNA基因位于内含子或是不编码蛋白的基因序列中，甚至位于外显子中，它们通常呈正向分布，多与其宿主基因(host gene)一起受到调节(Rodriguez et al., 2004; Baskerville et al., 2005; Kim et al., 2007)，但也有内含子miRNA并不和宿主基因共用转录起始和调控区，例如miR-499与其宿主基因myh7b (Wang et al., 2011)；位于基因间的miRNA则有自己的转录起始和调控区域；另有部分miRNA呈多顺反子形式排布，这并不表示成簇分布的miRNA在结构和功能上存在相似性，但它们通常共用一个启动子区域(Altuvia et al., 2005)，其启动子在模序结构上与由RNA聚合酶II (RNA polymerase II, Pol II)转录的编码功能蛋白基因的启动子相似(Lee et al., 2004; Zhou et al., 2007)。 4. miRNA的转录 一些类型的真核生物RNA转录酶已经很明确，如mRNA由Pol II转录，tRNA由Pol III转录，rRNA由Pol I转录。而miRNA的转录相对复杂，至今存在争议。miRNA可能由Pol II转录生成(Lee et al., 2004; Zhou et al., 2007)。Pol II结合在而后形成发夹结构的茎环DNA序列附近，生成的转录本经添加5帽子和3末端polyA等修饰。初级miRNA (primary miRNA, pri-miRNA)可能长达数千或数百核苷酸，可包含多个miRNA环结构(Cai et al., 2004; Lee et al., 2004)，位于基因内含子区的miRNA则认为其与宿主基因共转录生成pri-mRNA，经剪切为成熟mRNA和miRNA (Ying and Lin, 2005)。Pol III转录生成部分miRNA，尤其是上游为Alu序列，tRNAs和哺乳动物广泛散布重复(mammalian wide interspersed repeat, MWIR)启动子单元的miRNA (Faller and Guo, 2008)。 5. miRNA的核内处理过程 单个pri-miRNA可能含一到六个miRNA前体，每个由约70 nt左右的核苷酸形成发夹结构。每个发夹结构附以部分序列以利于有效剪切处理。pri-miRNA中的双链发夹RNA结构被叫做DGCR8 (DiGeorge syndrome critical region 8, 该蛋白因与迪格奥尔格综合症关系密切而得名，在非脊椎动物中称为Pasha)的核蛋白辨认，DGCR8同Drosha酶一起形成微处理器复合体(microprocessor complex) (Gregory et al., 2006)。在该复合体中，DGCR8组织Drosha蛋白的RNase III结构域，使其在距离发卡结构约11 nt处切割pri-miRNA，释放发夹结构。释出的发夹结构即为pre-miRNA，pre-miRNA 5为磷酸，3为羟基，且存在两个悬空的核苷酸。果蝇和线虫中存在由内含子直接剪切产生的pre-miRNA，并不经过微处理复合体过程，这种miRNA称为mirtron (Berezikov et al., 2007)。部分pre-miRNA可发生核RNA剪辑(RNA editing)，从而增加了miRNA的多样性(Ohman, 2007; Kawahara et al., 2008; Winter et al., 2009)。多数情况下，RNA腺苷脱胺酶(adenosine deaminases acting on RNA, ADAR)催化腺苷生成次黄嘌呤核苷(inosine)，RNA剪辑能够阻碍核内处理过程（例如导致pri-miR-142被核糖体酶Tudor-SN降解），并改变下游处理过程，包括胞浆处理和靶向特异性(Kawahara et al., 2008)。 6. miRNA的细胞核输出 pre-miRNA发夹通过Exportin-5蛋白的核胞浆穿梭完成从核输出到胞浆过程。Exportin-5蛋白为karyopherin家族蛋白成员，该蛋白通过辨认Drosha RNase III酶切割留下来的3两个悬空核苷酸，介导pre-miRNA的输出，该过程由GTP提供能量(Murchison and Hannon, 2004)。 7. miRNA的胞浆处理过程 在胞浆中，pre-miRNA发夹结构经RNase III Dicer切割处理(Lund and Dahlberg, 2006)。这种内切核糖核酸酶(endoribonuclease)与发夹结构的3相互作用，并在环的3和5臂上完成切割，产生长约22 nt不完美匹配的miRNA:miRNA*双链结构。发夹结构和茎环的大小以及miRNA:miRNA*双链结构的不完全匹配特性影响Dicer酶的切割效率(Ji, 2008)。虽然双链结构中的任何一条都可能成为功能miRNA，但通常只一链进入RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)，并与其靶基因mRNA发生相互作用。 8. miRNA在植物中的生成 miRNA在植物中的生成过程与在后生动物中不同，区别主要在核处理和输出过程上。与后生动物在核和胞浆中由两种不同的酶切割不同，在植物中，由Dicer酶的同源基因Dicer样酶1 (Dicer-like 1, DL1)完成切割处理过程，DL1只在植物细胞核中表达，表明两种反应都发生在核内。植物miRNA:miRNA*双链结构转运出核前，其3突出序列经RNA甲基转移酶HEN1 (Hua-Enhancer 1)甲基化修饰。而后此双链结构被Hasty (HST)由核输出至胞浆，在胞浆中解离生成成熟miRNA (Lelandais-Briere et al., 2010)。Hasty即为后生动物Exportin 5的同源蛋白。 9. miRNA诱导的沉默复合体 miRNA介导的RISC简称为miRISC (miRNA-containing RNA induced silencing complex) (Schwarz and Zamore, 2002)，也被称作miRNA核糖核蛋白复合体(microRNA ribonucleoprotein complex, miRNP)。该复合体除了包括成熟miRNA外，还包含Dicer蛋白和多种其它相关蛋白(Rana, 2007)。Dicer对pre-miRNA的处理与双链螺旋的解旋是偶联在一起的。通常情况下只有一条链进入miRISC，对双链中某一条链的偏好选择与碱基热动力学稳定性等因素有关。不进入RISC的链被称为伴随链(passenger)，其miRNA被冠以星号(*)，具有更低的稳定性，通常情况下被降解掉。在某些情况下，两条链都具有活性，成为针对不同靶基因mRNA的功能miRNA。Argonaute (Ago)蛋白成员在RISC功能中处于中心地位，其含有两个保守的RNA结合结构域，PAZ结构域结合导引链(guide) miRNA的3序列，PIWI结构域组装核酶H (ribonuclease-H)，并与miRNA 5端结合。Ago蛋白与miRNA结合使其正确朝向，以便与靶基因mRNA作用。Ago蛋白可能招募其它蛋白行使翻译抑制功能；一些Ago蛋白直接切割靶转录本(Pratt and MacRae, 2009)。在人类基因组中含有8个Ago蛋白，根据序列相似性分为两个家族：AGO和PIWI。AGO蛋白有4个成员，存在于所有哺乳动物细胞中，在人类这类蛋白称为E1F2C/hAgo；PIWI存在于精细胞和造血干细胞中(Schwarz and Zamore, 2002)。RISC的其它组成成分还包括人类免疫缺陷病毒活化反应RNA结合蛋白(human immunodeficiency virus transactivating response RNA binding protein, TRBP), 干扰素诱导的蛋白激酶活化因子(protein activator of the interferon induced protein kinase (PACT), 运动神经元存活复合体(survival of motor neurons complex)，脆性X智障蛋白(fragile X mental retardation protein, FMRP)和Tudor葡萄球菌核酸酶结构域包含蛋白(Tudor staphylococcal nuclease-domain-containing protein)等(Mourelatos et al., 2002; Murchison and Hannon, 2004; MacRae et al., 2008)。 10. miRNA诱导的基因沉默模式 在大多数情况下，复合物中的单链miRNA与靶mRNA的3 UTR不完全互补配对，阻断靶基因的翻译，这种方式主要影响蛋白表达水平，并不影响mRNA的稳定性。另一种作用方式与siRNA诱导的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)类似，当miRNA与mRNA完全互补配对时，Ago2蛋白通过切割mRNA直接导致其降解，实现基因沉默。另外，近来发现miRNA能加速mRNA脱腺苷酸化(accelerated deadenylation)而抑制基因表达；miRNA还能通过导致组氨酸修饰和启动子区的DNA甲基化影响靶基因的表达(Kim et al., 2008; Sinkkonen et al., 2008)；此外，研究发现miRNA存在与5 UTR相互作用(Orom et al., 2008)和上调基因表达(Vasudevan et al., 2008)，由胞浆转运入核(Hwang et al., 2007)等多种作用模式。 11. miRNA诱导基因沉默的机制 11.1. miRNA的翻译起始抑制与翻译起始后抑制 目前对miRNA翻译起始抑制机制主要有如下几种观点：miRNA通过抑制全能核糖体的组装而阻断翻译起始(Chendrimada et al., 2007)。另一种观点根据miRNA抑制需靶mRNA m7G帽子结构存在，认为miRISC可能抑制翻译起始复合物的形成(Humphreys et al., 2005; Pillai et al., 2005; Mathonnet et al., 2007)；Ago2中间结构域具有结合m7G帽子的活性，Ago2经miRNA招募到靶mRNA 3 UTR，与起始复合物eIF4E/G竞争性结合m7G帽子，抑制翻译起始复合物的形成(Kiriakidou et al., 2007)。还有观点认为miRNA通过阻止polyA结合蛋白(polyA binding protein, PABP)与mRNA结合影响翻译起始(Wakiyama et al., 2007)，引起靶mRNA脱腺嘌呤反应，导致RNA的polyA尾缩短，使PABP结合mRNA受阻，从而影响翻译起始。 研究发现一些被miRNA抑制的mRNA与翻译活跃的多核糖体偶联；此外，经内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES)起始、不依赖于mRNA m7G帽子的翻译过程也能被miRNA抑制，表明miRNA抑制可能发生在翻译起始之后(Petersen et al., 2006; Wu et al., 2006)。至于miRNA引起新生多肽链的翻译同步降解，还是在翻译延伸过程中引发翻译提前终止，当前没有定论。 11.2. miRNA介导mRNA衰减 miRNA诱导与之不完全配对靶mRNA衰减，下调靶mRNA的水平。发现Ago蛋白定位于RNA颗粒(RNA granules)，如P小体(processing bodies, P-bodies)中，这些RNA颗粒中包含mRNA降解酶，可能参与miRNA介导的mRNA衰减(Sen et al., 2005)。 12. miRNA的周转与修饰 miRNA需要快速实现周期轮转(turnover)以适应对生理功能调控的需求。当miRNA在胞浆中成熟时，Ago蛋白结合miRNA过程具有稳定引导链的作用，而同时互补的伴随链被降解消除。Ago蛋白倾向于保留下可以调控大量靶基因的miRNA，而清除靶向基因较少和没有任何靶基因的miRNA (Kai and Pasquinelli, 2010)。在动物中，成熟miRNA的衰减由5-3外切核酸酶Rat1p/Xrn2p负责，在植物由小RNA降解核酸酶(small RNA degrading nuclease, SDN)家族成员来执行此功能，且方向相反(3-5) (Chatterjee and Grosshans, 2009; Kai and Pasquinelli, 2010)。在多种模式生物（包括拟南芥）的研究均表明miRNA修饰过程影响miRNA的稳定性，植物miRNA可通过3端的甲基化增强miRNA的稳定性。植物和动物miRNA都可以发生3腺苷酸修饰，例如肝脏高丰度表达的miR-122，其腺苷酸修饰具有稳定miRNA的作用，在植物中也发现腺苷酸修饰可以延缓miRNA的降解速率(Kai and Pasquinelli, 2010)。 13. miRNA的进化 miRNA在从褐藻到后生动物中普遍存在(Cock et al., 2010)。虽然在细菌中没有发现miRNA，但是同样存在短的RNA序列（通常50到数百个核苷酸长），发挥与miRNA相类似的功能(Tjaden et al., 2006)。miRNA使基因表达调节更精细，更具有特异性，更有利于复杂器官的生成，并可能最终导致了复杂生命的出现(Heimberg et al., 2008; Peterson et al., 2009; Wheeler et al., 2009)。事实上，进化上的形态学大爆发通常伴随了miRNA的激增。miRNA通常起源于DNA非编码区域随机生成的发夹结构，部分miRNA源于已存在miRNA的复制和修饰(Nozawa et al., 2010)。最近起源的miRNA进化速度（如核酸置换）与其它非编码DNA相当，暗示其通过中性漂变的形式演化；起源古老miRNA均有很低的进化速度，表明miRNA取得一项功能经历了极其精准的选择过程(Peterson et al., 2009; Nozawa et al., 2010)，在这种情景下，miRNA很难在基因组中丢失。而最近起源的miRNA，通常可能没有获得重要的功能，更容易在进化中丢失。较古老miRNA因其进化率低成为重要的分类学标志物(Wheeler et al., 2009)，可能有利于解决存在争议类群（如节肢动物）的分类学问题(Caravas and Friedrich, 2010)。 14. miRNA的识别和预测 miRNA具有独特的结构和特性：包括miRNA前体具有发夹或折叠的二级结构，不含有大的内部环状结构和突起，成熟的miRNA位于发夹结构的茎部，由Dicer加工而成，成熟miRNA长约22 nt左右，其序列在不同物种间保守等。现今可通过计算机软件预测和分子生物学实验方法发现miRNA。 14.1. 计算机分析法 随着不同生物基因组测序的完成和对miRNA结构和构象特征的深入认识，利用计算机程序对基因序列进行搜索大大提高了发现miRNA的效率。miRNA预测软件包括miRseeker, snarloop, RNAz和MirScan等。计算机预测法的主要依据包括：首先，miRNA二级结构中发夹结构特性；其次，miRNA序列和结构的保守性，这是区分miRNA候选基因和其它不相关发夹结构序列的关键因素；另外，发夹结构的热力学稳定性等。很多miRNA以多拷贝或基因簇等形式存在于基因组中，因此利用已知miRNA基因附近的序列来寻找潜在的miRNA基因也是一个有效的方法。但是软件分析法存在一个明显的缺陷：目前对miRNA的认识还不足以使计算机可以精确鉴定miRNA，设置严格的检测标准将降低预测的敏感性，而较宽松的标准则其准确度会下降，因此预测仅局限于序列保守的RNA，不能预测不具有保守性的稀有miRNA。 14.2. 实验方法鉴定miRNA 现今发展了多种克隆小RNA的实验方法，不同的小RNA克隆方法基本原理一致(Aravin and Tuschl, 2005)。首先将提取的总RNA通过变性凝胶电泳分离回收长度20-25 nt的小RNA，将5和3端接头结合于小RNA两端，RT-PCR扩增小RNA片段，获得cDNA片段后克隆入载体表达，构建cDNA文库，再通过测序、同源性比对确定小RNA。大部分已知的miRNA都是通过cDNA克隆测序发现和鉴定的。miRNA扩增谱技术(miRNA amplification profiling, mRAP)先在miRNA的3端连上接头，然后用与接头互补的反转录引物反转录。因为特定的反转录酶具有末端脱氧核苷酸转移酶活性，一些核苷酸(主要是脱氧胞苷酸)会连接到反转录出的cDNA链的3末端。当5端接头与cDNA链的poly(C)粘性末端退火后，加入一对共用引物即可实现对cDNA的PCR扩增(Mano and Takada, 2007)。在基因表达系列分析(serial analysis of gene expression, SAGE)技术的基础上发展了miRNA SAGE法(miRAGE)，通过单个测序反应可检测多个miRNA (Cummins et al., 2006; Ge et al., 2006)。新一代大规模测序技术，包括焦磷酸测序技术(pyrosequencing), Solexa测序技术和SOLID测序技术等(Glazov et al., 2008; Morozova et al., 2008; Szittya et al., 2008; Chellappan et al., 2009; Rathjen et al., 2009)，极大提高了测序效率，提高了多个物种遗传信息的解读速度，为获取所有miRNA的序列信息，解密miRNA图谱提供了保证。 15. miRNA表达研究 如果某miRNA在特定组织、细胞或者发育阶段中特异性表达，此miRNA可能在其中发挥某种调控作用。要了解miRNA时序、空间的表达情况及其病理过程中所发挥的作用，必需有合适的方法检测miRNA的表达水平，在此基础上开展功能研究。现阶段检测miRNA的表达的方法主要包括基于核苷酸杂交和基于PCR两类检测方法。基于探针杂交的miRNA检测方法为直接检测法，不需要对样本RNA进行预扩增，包括RNA印迹、原位杂交(in situ hybridization)、微阵列(microarray)和基于微球的流式细胞术(bead-based flow cytometry)等技术(Ambros et al., 2004; Liu et al., 2004; Chen et al., 2005; Raymond et al., 2005; Shi et al., 2005; Grundhoff et al., 2006; Beuvink et al., 2007; Pall et al., 2007; Varallyay et al., 2007; Yao et al., 2007; Castoldi et al., 2008)。基于扩增反应的方法包括茎环引物逆转录实时定量PCR法(stem-loop real-time PCR), RNA加尾和引物延伸RT-PCR法以及滚环扩增法(rolling-circle amplification, RCA)等。 15.1. Northern杂交 为最经典的检测真核生物RNA大小，估计其丰度的实验方法。待测样本经变性凝胶电泳、转膜、烘干等步骤，使RNA牢固地结合在膜上。将膜与标记好的变性RNA探针杂交、洗膜、显影后，对条带进行光密度扫描，根据条带分子大小以及密度确定miRNA表达量。信号标记包括同位素标记、荧光标记和纳米金标记等方法。但Northern技术过程烦琐，操作费力，对RNase敏感，更有难于检出表达量很低miRNA的缺点。 15.2. miRNA表达谱芯片 原理同样是使用标记探针检测固相支持物上的目标分子。基因芯片具有高通量的优点，可一次检测几百个miRNA的表达，现今广泛应用于功能miRNA的初步筛选。Luminex公司研制了液相芯片(liquid chip)，又称多靶点悬浮点阵(multi analyte suspension array, MASA)或FMAP (flexible multianalyte profiling)，该方法将流式检测与芯片技术有机地结合起来，兼有通量大、检测速度快、灵敏度高和特异性好等特点。 15.3. 核酶保护分析技术(ribonuclease protection assay, RPA) miRNA的检测还可以采用RPA，将标记好的探针和待测RNA样本混合杂交，未杂交的RNA和多余的探针用单链核酸酶消化，热失活核酸酶后纯化受保护的RNA分子，最后通过变性PAGE电泳分离，显色(Ouellet et al., 2008)。 15.4. RAKE法(RNA-primed array-based Klenow emzyme assay) 在miRNA芯片基础上发展而来，利用DNA聚合酶I的Klenow片段使miRNA与固定的DNA探针杂交，扩增(Allawi et al., 2004; Nelson, 2004)。RAKE可以敏感特异地区分同一miRNA家族的不同成员。 15.5. 原位杂交 原位杂交技术可直观了解miRNA表达方式，是观测miRNA时空表达的一种较简便的方法，还适用于石蜡包埋或福尔马林固定后的标本。标记方式包括地高辛、生物素、荧光标记等。内源性miRNA互补的锁核酸(locked nucleic acid, LNA)寡核酸具有更强的杂交特性和敏感性选择性，基于锁核酸的原位杂交(locked nucleic acid based in situ hybridization, LNA-ISH)是原位检测miRNA的理想选择(Kaur et al., 2006; You et al., 2006)。 15.6. 实时荧光定量PCR技术(real-time PCR, RT-PCR) 荧光检测PCR仪可对整个PCR过程中扩增序列的累积速率绘制动态变化曲线。在反应混合体系中靶序列的起始浓度越大，获得扩增产物某特定量的PCR循环数（一般用特定阈值循环数Ct来表达）越少。由于miRNA长度仅为22 nt，传统的RT-PCR不适合扩增如此短的片段。茎环引物法可很好的解决之一难题，原理如下：设计特殊的茎环结构引物，以待测miRNA为模板逆转录合成cDNA第一链，该cDNA末端为茎环状引物，茎环状结构被打开便增加了cDNA的长度，随后以合成的cDNA为模板进行实时定量PCR扩增。 15.7. 基于padlock探针和滚环扩增的miRNA检测系统 Padlock探针为线性的DNA探针，其末端序列分别可以和miRNA的两端互补杂交。在合适的条件下，当padlock探针与靶miRNA杂交时，DNA连接酶将padlock探针的3和5末端连接成环，其中miRNA模板随后用作滚环扩增的引物，从而实现对目标序列的扩增。 16. miRNA靶标的预测和鉴定 绝大多数miRNA通过碱基互补配对的方式结合靶mRNA的3 UTR，抑制靶基因翻译达到调控基因表达的目的，因此miRNA靶标鉴定对研究miRNA的功能至关重要。虽然到目前为止，已经有16,700多条miRNA被收录，但其功能研究进展相对缓慢。阻碍miRNA功能研究进展的主要原因是miRNA与其靶基因并非完全匹配，这给筛选miRNA靶基因带来相当难度；而当前缺乏高通量，用于靶标确定的实验技术是阻碍miRNA靶标鉴定进程的主要因素。miRNA与其靶基因存在如下重要特征：靶基因3 UTR区具有与miRNA 5端至少7个连续核苷酸的完全配对区域(2-8 nt)，即种子序列；mRNA与miRNA种子序列互补的区域在物种间经常具有保守性。研究人员根据对miRNA及其靶mRNA特征的认识，开发了多种计算机软件用于预测miRNA的靶基因。 16.1. miRNA靶标预测高效性影响因素 最初的几个miRNA (如let-7和lin-4)的靶标确定后，研究人员意识到miRNA与靶标转录本的3 UTR互补配对，认为可以根据这一特点设计计算机程序进行靶标筛选。但是实践操作过程中，只依据靶标和miRNA互补配对这一原则远远不够，筛选的效率还受以下几个方面因素的制约：第一，植物miRNA与靶标基因几乎完全配对，靶标基因的鉴定相对容易，但动物miRNA与靶基因mRNA以不完全碱基互补配对方式结合于3 UTR，给通过序列相似性鉴定miRNA结合位点带来困难。第二，miRNA是序列短小的小分子，与3 UTR结合的方式存在多样性，结合位点除了配对区还存在突环和错配区，一般的分析工具只对配对区较长，突环和错配区很少的靶标鉴定效率相对较高。第三，miRNA 2-7 nt种子区与靶标精确配对，如果进行大规模种子区与已有物种的全基因组序列配对，在基因组中6个碱基随机出现的几率相对较高，预测出的靶标假阳性现象严重。第四，尽管很多生物的全基因组序列测序工作已经完成，但是对3 UTR碱基序列、座位、剪接多态性等认识尚浅。第五，靶标预测过程中排除那些不具有物种间保守性的靶标能降低假阳性概率，但3 UTR序列保守性不是绝对的，排除所有不保守序列降低了预测的灵敏度。 16.2. miRNA预测原则和软件介绍 当前没有高通量的miRNA靶标鉴定方法，一般实验方法耗时耗力，因此，虽然靶基因预测存在上述多种困难，理论预测miRNA的靶标依旧是当前较为理想的途径。一般情况下，用于miRNA靶基因预测的软件遵循如下几个原理：(1) 序列互补性：miRNA 5端种子序列(第2-7 nt)与靶基因3UTR可形成Watson-Crick配对是几乎所有miRNA靶基因预测软件考虑的最重要因素。配对包括如下几种形式：多数情况下为7 nt匹配：第2-7 nt与靶基因呈互补配对，外加在靶基因对应miRNA第1位核苷酸处为A (7mer-1A site)，或是miRNA第2-8 nt与靶基因完全配对(7mer-m8 site)；而对于miRNA第2-8 nt与靶基因完全配对，且外加靶基因对应miRNA第1位核苷酸处为A (8mer site)这种类型，特异性更高；对于仅miRNA第2-7 nt与靶基因完全配对(6mer site)这种方式，其用于搜索靶基因的敏感性更高，但特异性相应下降。另外，还有种子序列外3 supplementary site和3 complementary site两种形式(Bartel, 2009)。(2) 序列保守性及其它因素：除了序列互补性外，靶基因预测还关注序列保守性、热动力学因素、位点的可结合性(accessibility)和3 UTR碱基分布等多个因素。miRNA结合位点在多个物种之间如果具有保守性，则该位点更可能为miRNA的靶位点。miRNA:靶标对形成的自由能越低，其可能性越大。位点的可结合性指mRNA的二级结构是否影响与miRNA结合形成双链的能力。miRNA结合位点在3 UTR区的位置和相应位置的碱基分布也影响miRNA与靶位点的结合和RISC效率。另外，诸如miRNA的分布与靶基因组织分布的相关性也是靶基因预测时要考虑的重要因素。miRNA靶基因预测的软件种类很多，包括miRanda, EMBL, PicTar, TargetScan(S), DIANA-microT 3.0, PITA, ElMMo, rna22, GenMiR+, TarBase, miRBase, miRGen-Targets等(Enright et al., 2003; Lewis et al., 2003; Krek et al., 2005; Griffiths-Jones et al., 2006; Sethupathy et al., 2006; Wang, 2008; Wang et al., 2008; Gennarino et al., 2009)。TargetScan要求seed严格配对（预测保守的与miRNA种子序列匹配的8mer和7mer位点），延伸序列直到不配对的区域，同时预测物种间不保守的靶位点和存在补偿性3碱基对的序列。PicTar充分考虑了物种间保守性，miRNA-靶标复合体热力学稳定性等因素(Krek et al., 2005)。 17. miRNA功能的研究方法 预测得到的miRNA靶标常需通过生物学方法进行鉴定(Kiriakidou et al., 2004)，同时miRNA功能确认也需要开展详细的实验研究。常用方法包括：报告基因法，突变技术，基因沉默技术以及经典遗传学技术。研究miRNA对靶基因的作用与一般的基因研究方法类似，上调miRNA表达水平观测功能获得型(gain-of-functon)表型，而下调或抑制miRNA的表达观测功能丧失型(loss-of-function)表型。可通过构建pre-miRNA表达载体并转染细胞，通过细胞中各种酶以及蛋白作用产生miRNA，可以使用与内源性miRNA互补的LNA, antagomir或Morpholino探针(morpholino phosphorodiamidate antisense oligonucleotides)抑制miRNA的作用。Thermo旗下Dharmacon团队研发的miRNA模拟物(mimics)和发夹阻遏物(hairpin inhibitor)转染细胞，增强或者抑制内源成熟miRNA，也是研究miRNA功能的重要工具。 转基因技术(transgeneic technology)通过将外源DNA导入动物受精卵或胚胎干细胞内，以随机插入或同源重组的方式整合到受体染色体中，并随细胞分裂而遗传给后代。转基因动物对研究特定基因的功能具有重要的作用，因基因表达水平转基因可分为：过表达(over expression)、基因敲除(knockout, KO)及基因敲减(knock down)等类型。随着时间推进，miRNA转基因动物模型正成为miRNA功能研究的有力工具，miRNA转基因动物构建策略也不断丰富和翻新。典型的miRNA转基因构件包括：启动子, pre-miRNA, pre-miRNA侧翼序列及转录终止信号等。miRNA的表达具有时序和组织特异性，用条件基因打靶(conditional gene targeting)构建组织特异的miRNA敲除动物是研究其功能的良好解决方案。 18. miRNA的细胞功能及意义 miRNA在植物和动物中广泛存在，miRNA数据库(miRBase, /)现已收录16,700多条序列信息。miRNA的广泛性和多样性表明其具有重要生物功能。miRNA是高等植物、动物生长发育的重要调节因子，miRNA在胚胎干细胞发育、细胞分化与器官发生、增殖和凋亡、内分泌与代谢、免疫调控和疾病病理过程调节中发挥着重要作用。尽管当前对miRNA的研究还处于初级阶段，但推测高级真核生物体内miRNA对基因表达的调控作用可能和转录因子(transcription factor, TF)同等重要，miRNA代表了在一个新层次上的基因表达调控方式。一些TF与miRNA交互作用，共同构成了复杂的基因调控网络。 18.1. miRNA与发育和细胞分化 miRNA参与了在细胞分化和组织发育过程中起重要作用基因的转录后调控，首先被确认的miRNA lin-4和let-7可以通过调节关键mRNA的翻译调控线虫发育进程。有些miRNA为干细胞特有，推测是维持细胞全能性所必需，并参与细胞分化过程，而一些组织特异性表达miRNA与维持细胞分化关系密切，例如miR-1，在心肌和骨骼肌中特异表达，心脏形成的关键调节因子Hand2是miR-1的靶标基因，miR-1能适时关闭Hand2蛋白，促使心脏正常发育。 18.2. miRNA与细胞增殖和调亡 果蝇bantam是第一个被鉴定与细胞凋亡和增殖相关的miRNA。bantam的靶基因hid是一种调亡诱导基因，bantam与hid mRNA的3 UTR互补结合，阻止hid mRNA的翻译，表现促细胞增殖的作用，敲除bantam上调hid的表达水平，表现抑制细胞增殖和诱导调亡作用。 18.3. miRNA与疾病 miRNA参与了包括心肌肥大和心电传导等病理过程(van et al., 2006, 2007; Tatsuguchi et al., 2007; Thum et al., 2007; Yang et al., 2007; Zhao et al., 2007; Chen et al., 2008)；组织特异性miRNA，如miR-375，参与了胰岛素分泌的出胞过程；miRNA可以调节神经系统，神经元miRNA参与突触发育的多个阶段，包括树突发生(miR-132, miR-134和miR-124)，突触形成和突触成熟(miR-134和miR-138)等过程，研究还发现miRNA在精神分裂症患者表达发生改变，可能参与了精神疾病的病理过程。 18.4. miRNA与恶性肿瘤 超过一半的miRNA位于脆性位点(fragile site)，杂合型丢失区(minimal regions of loss of heterozygosity), 微小扩增区(minimal regions of amplication, minimal amplicons)或断裂点区(common breakpoint region)，miRNA与人类肿瘤的关系引起了人们的广泛关注(Calin et al., 2004; He et al., 2005; Lu et al., 2005; Mraz et al., 2008)。miRNA表达水平的变化导致瘤基因或抑癌基因转录后的调控异常，发挥着原癌基因和抑癌基因的作用。若miRNA的靶基因是癌基因，此miRNA的表达低于正常水平，意味