硫酸皮肤素.doc

乙基紫与硫酸皮肤素相互作用的共振瑞利散射光谱及其分析应用目 录摘 要 1ABSTRACT11前 言2 1.1共振瑞利散射的发展和应用2 1.1.1光散射现象2 1.1.2瑞利散射2 1.1.3共振瑞利散射2 1.2硫酸皮肤素研究3 1.2.1硫酸皮肤素的性质和应用3 1.2.2硫酸皮肤素含量的测定方法42实验部分4 2.1仪器和试剂4 2.2实验方法53结果与讨论5 3.1光谱特征53.1.1 RRS光谱53.1.2吸收光谱5 3.2适宜的反应条件63.2.1酸度的影响63.2.2染料用量的影响63.2.3反应速度极其稳定性63.2.4离子强度的影响73.2.5表面活性剂的影响7 3.3共存物质的影响7 3.4工作曲线8 3.5分析应用83.5.1血清中硫酸皮肤素含量的测定83.5.2尿样中硫酸皮肤素含量的测定8结 论9参考文献9- 11 -乙基紫与硫酸皮肤素相互作用的共振瑞利 散射光谱及其分析应用王晓源（西安文理学院化学与化工系，西安市太白南路 168 号，710065）摘要： 在 pH 5.56.5 的 Britton-Robinson 缓冲溶液中，乙基紫与硫酸皮肤素作用形成结合产物时将导致溶液共振瑞利散射（RRS）大大增强并产生新的 RRS 光谱，其最大散射峰位于 498 nm 处，另在 327 nm 和 650 nm 处有两个较弱的散射峰。硫酸皮肤素浓度在 01.6 mg/L 范围内，与 RRS 强度有良好的线性关系。据此，建立了一种新的测定硫酸皮肤素的分析方法。该法具有高灵敏度，对硫酸皮肤素的检出限（3）为 5.0 ng/mL，选择性良好。应用于血清和尿样中硫酸皮肤素的测定，结果令人满意。关键词：硫酸皮肤素；乙基紫；共振瑞利散射 Resonance Rayleigh Scattering Spectra of Interaction of Dermatan Sulfate with Ethyl Violet and Its Analytical ApplicationWang Xiaoyuan(Department of Chemistry, Xian University of Arts and Science, Xian 710065)Abstract：In a buffer medium of pH 5.56.5, a compound complex was formed between Dermatan Sulfate (abbreviated as DS) and Ethyl Violet (abbreviated as EV), leading to a great enhancement of the intensity of resonance rayleigh scattering (RRS) and giving a new RRS spectrum. The maximum scattering peak is located at 498 nm and two relativetely weaker peaks are located at 327 nm and 650 nm. It was also found that the intensity of RRS was directly proportional to the concentration of DS in the range of 01.6 mg/L. Based on these facts, a sensitive method for the determination of DS was proposed. The detection limit (3) of this method was found to be 5.1 ng/ml. Good selectivity of the method was shown by the results of interference test. The proposed method has been used for the determination of total amounts of dermatan sulfate in samples with satisfactory results.Keywords:Resonance Rayleigh Scattering; Dermatan Sulfate; Ethyl Violet 1前言：1.1共振瑞利散射的发展和应用1.1.1光散射现象光散射是一种比较常见的自然现象，广泛存在于光与粒子的作用过程中，是指一束光通过介质时，在入射光方向以外的各个方向上观察到光辐射的现象，它的实质是说光波的电磁场与介质分子相互作用的过程。光散射与介质的不均匀性密切相关，但是除了真空以外的其它所有介质都有一定程度的不均匀性，从而产生散射光，由于介质的不均匀产生不同种类的散射。当有光入射时，每个区域成为散射中心，向四面八方发出相同频率的次波，这些次波间无固定相位关系，它们在某方向上的非相干叠加形成了该方向上的散射光。根据散射光与入射光波长的关系，光散射可分为：弹性散射、非弹性散射、准弹性散射。在三类散射中，非弹性散射研究是最深入、应用最广泛的，其次是作为弹性散射的瑞利散射。1.1.2瑞利散射瑞利散射 (Rayleigh Scattering，RS)是指散射光波长等于入射光波长，而且散射粒子（通常是分子）远小于入射光波长的散射。由英国物理学家瑞利提出而得名。瑞利散射是一种发现较早、研究较多并且应用较广的光散射，自发现后经历一百三十多年的发展与完善，至今已建立了比较完善的理论体系并在物理学、天文学1和化学等很多领域得到了广泛的应用。其中在化学领域中的应用是:分子量的测定、分子回转半径、形状和大小的测定，缔合聚合反应过程动态行为的研究以及一些物理化学参数的测定等。尽管瑞利散射技术已得到广泛的应用并为研究工作提供了大量的信息，但该技术存在两大不足：（1）信号水平低，一般仅有入射光强度的千分之一左右；因此必须使用价格昂贵的激光光源，这不仅不能提供较完整的瑞利散射光谱，而且即便使用激光光源，对于研究一些极稀溶液中物质的浓度和结构信息也非常困难；（2）选择性低，不同物质均遵守瑞利定律，无特征峰，因此限制了它的应用。若在散射实验中，选择入射光波长接近待测物质的吸收带时，该物质的散射会大大增强，而且会出现新的散射特征，这就是共振瑞利散射，它的出现大大弥补了瑞利散射的不足，并使散射技术得到了新的研究和应用。1.1.3共振瑞利散射共振瑞利散射 (Resonance Rayleigh Scattering，RRS) 是指当入射光位于或接近于分子吸收带时，由于电子吸收电磁波频率与散射频率相同，电子因共振而强烈吸收光的能量并产生再次散射。这种吸收-再散射过程称为共振瑞利散射或共振增强瑞利散射。人类于 1978 年用宏观波动理论对最大吸收附近的瑞利光散射进行了理论处理，在此基础上 Anglister 和 Steinberg 进行了修正，以包括溶质最大吸收处的散射光2。上述理论不仅与大量实验事实相吻合3 , 而且为研究溶质分子的聚集状态奠定了理论基础。共振瑞利散射与瑞利散射相比，具有以下优点：有更高的灵敏度、检测更为方便、有更好的选择性、可为研究分子结构和反应特征提供更丰富的信息及共振瑞利散射对于大分子非键作用。共振瑞利散射的分析应用及其发展前景：20世纪30年代，Plazek 在预测共振 Raman 散射的同时预测了有共振 Rayleigh 散射现象的存在。但直到1975年才由Bauer等人发现并用于研究二苯基卟啉。80年代以后Miller利用宏观波动理论对其进行了理论研究。后来Anglister等人对该理论进行了修正，使共振瑞利散射理论进一步得到完善。1993年 Pasternack等第一次在荧光分光光度计建立了共振光散射技术，并用该技术研究卟啉类化合物在核酸分子上的J型堆积，此技术率先用于核酸的研究和检测4，随着后来的研究显示出该方法在生物大分子的识别、组装、超分子排列5以及多个分析领域的应用前景很好，这一成果引起了国内分析工作者的浓厚兴趣和广泛关注。在我国，刘绍璞教授等率先应用并研究小分子之间静电引力、疏水作用和电荷转移作用形成离子缔合物而产生的强烈共振瑞利散射信号，从另一角度丰富和拓展了研究内容。目前，共振瑞利散射技术已成功的应用于生物大分子，如蛋白质6-8、核酸9-12的研究；抗生素13,14和一些天然药物15，16的分析应用；以及表面活性剂和有机物分析；也可用于液相纳米粒子17-19的分析和表征以及某些物理化学参数20的测定。自1993年以来，共振瑞利散射技术由于灵敏度高、仪器简单便宜，已得到了广泛的应用，荧光仪和别的分析仪器的联用也得到了较好的发展，如：共振散射技术与流动注射联合使用分析测定肝素；共振散射技术和高效液相色谱和毛细管电泳仪的联用。随着科学研究和分析技术的不断发展，目前所使用的仪器，如果狭缝过宽，共振瑞利散射光谱中存在动态的成分，且不利于光谱精细结构的研究；如果狭缝过窄，虽然可能得到较为纯净的共振瑞利散射增强信号，但由于氙灯发出的能量小，检测器检测到信号较弱，影响分析方法的灵敏度。随着激光技术的进一步发展，有望采用大些功率的激光光源进行光谱精细结构研究，并进一步提高检测的灵敏度。尽管共振瑞利散射技术得到了广泛的应用，但对它的产生机理研究还有很多不够清楚的地方，有些实验现象和结果还不能得到很好的解释，所以，该技术要得到进一步的完善和成熟，就还有很多工作要做，在这些未知领域得到更清楚的认识后，共振瑞利散射技术会更加完善并得到广泛的应用。1.2硫酸皮肤素研究1.2.1硫酸皮肤素的性质和应用多糖分子因具有广泛的生物活性功能受到广泛的关注。比较常见的生物活性功能有:作为植物、动物骨架的原料，能量储存形式，复杂的生物功能(如血型决定簇、细胞识别等)。糖胺聚糖是重要的多糖，由重复的二糖结构单元组成，带有负电荷的长链，作为蛋白聚糖的一部分，广泛存在于脊椎动物组织的细胞外基质中，具有许多方面的生物活性，多数无毒，是当前药物研究的热点之一。糖胺聚糖主要包括硫酸皮肤素、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素、硫酸类肝素和肝素。肝素具有抗凝血作用，在血渗析和体外血循环中起到防止血液凝固的作用，还可防止血栓生成。透明质酸可增加关节间的润滑性，在剧烈运动时起减震作用，使关节免受伤害。硫酸皮肤素（Dermatan Sulfate，DS）是在哺乳动物真皮中发现的一种黏多糖类化合物。DS以L-艾杜糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸所形成的二糖单位的重复结构为主体。性状为冻干粉末，无臭，无味，易吸湿，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮。DS是一种新型的抗血栓药物，具有抗凝、抗栓、抗炎、抗病毒、抗增殖以及保护血管壁等作用，而且还具有生物利用度高、出血副作用小、口服可吸收等优点，故已开发成为一类很有前途的新型抗血栓药物。目前，国际上所用的DS药物多由意大利米兰 Medlolanum 药厂提供，是猪肠黏膜 DS制剂，而国内该药物还暂未有成品上市，正处于研发试验阶段。因此，对硫酸皮肤素进行深入研究是一项非常重要和紧迫的任务。1.2.2硫酸皮肤素含量的测定方法目前国内外对硫酸皮肤素的分析测定方法研究甚少，主要有：电泳层析法，高效液相色谱法，重量分析法等。上述方法存在较大的不足，有的操作复杂、需要预先分离提纯、有的灵敏度不高、选择性较差、有的仪器价格比较昂贵等缺点。因此进一步研究灵敏度高、选择性好、操作性简便的新方法具有重要的研究意义。近几年来，共振瑞利散射光谱分析法(RRS) 作为一种新的分析技术，用于多糖、核酸和蛋白质等生物大分子的分析，获得了极高的灵敏度，且具简易性，为大分子分析开辟了一条新途径。2 实验部分2.1 仪器和试剂RF-5301PC 荧光分光光度计(日本岛津公司)；TU-1810 紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；PB-10 酸度计(北京赛多利斯科学仪器有限公司)。硫酸皮肤素（美国Sigma公司）标准溶液：准确称取0.1000 g硫酸皮肤素于50 mL烧杯中，加水溶解后，转入100 mL 容量瓶中，以水定容，此储备液浓度为1 mg/mL，冰箱保存，使用时稀释至10 g/mL工作液；乙基紫（美国Chroma公司）水溶液：2.010-4 mol/L；Britton-Robinson 缓冲溶液：用0.04 mol/L H3PO4 ，H3BO3 和 CH3COOH与 0.2 mol/L NaOH 按照一定比例混合，配成不同 pH 值的缓冲溶液，并用酸度计校正 pH 值。所用试剂除特别说明外，均为分析纯，水为蒸馏水再经Simplicity185型离子交换纯水器交换提纯。2.2 实验方法在10.0 mL比色管中，依次加入适量的DS标准溶液、1.0 mL pH 6.0的Britton-Robinson 缓冲溶液、0.6 mL 2.010-4 mol/L EV 溶液，加水稀释至刻度，摇匀，放置10 min。在荧光分光光度计上，选择激发和发射狭缝宽度均为10 nm，以ex=em进行同步扫描，记录共振瑞利散射光谱，并于 498 nm 处分别测量离子缔合物的 RRS 强度 IRRS 和试剂空白的 RRS 强度 I0RRS ，计算：IRRS = IRRS - I0RRS 。3 结果与讨论3.1 光谱特征3.1.1 RRS 光谱 按 2.2 实验方法，在 RF-5301 PC 荧光分光光度计上分别对试剂空白、DS 溶液和离子缔合物溶液用 =0 nm 进行同步扫描，得到 RRS 光谱，如见图 1 所示。从图 1 可知，DS 和 EV 本身的 RRS 均非常微弱，几乎无峰，但当两者反应形成大分子离子缔合物时，共振瑞利散射显著增强，并在 327 nm、498 nm 和 650 nm 处产生三个清晰的散射峰。 图 1 DS-EV体系的RRS光谱图Fig.1 RRS spectra of DS-EV system1：DS；2：EV；311：DS-EVpH=6.0；c EV =1.210-5 mol/L；cDS(1)= 1.0 g/mL；cDS (311): 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 ，1.4，1.6，1.8g/mL3.1.2 吸收光谱 按 2.2 实验方法配制溶液，以试剂空白为参比，在 TU-1810 紫外可见分光光度计扫描，得到 DS-EV 体系的吸收光谱如图 2 所示。由图可知，缔合物有 3 个吸收峰分别位于 311 nm、552 nm 和 596 nm 处，可见共振瑞利散射光谱与吸收光谱有很好的对应关系，其瑞利散射峰分别位于或接近相应的吸收峰，在这些波长处通过散射-吸收-再散射过程，产生共振增强效应，使瑞利散射强度显著增强。 图 2 DS-EV 体系的吸收光谱 Fig.2 Absorption spectra of the DS-EV systempH=6.0；c EV=1.210-5 mol/L；cDS= 1.0 g/mL 3.2 适宜的反应条件3.2.1 酸度的影响 利用不同 pH 的 Britton-Robinson 缓冲溶液研究了酸度对体系 RRS 强度的影响如图 3 所示。由图可知，在 pH 值在 5.56.5 范围内，体系 RRS 强度达到最大且基本恒定，实验选用 pH 为 6.0 的 Britton-Robinson 缓冲溶液，最佳缓冲用量范围为 0.52.0 mL，选用 1.0 mL。 图3酸度的影响 图 4 EV的影响 Fig.3 Effect of pH Fig.4 Effect of EV3.2.2 染料用量的影响 固定 DS 的浓度为 1 g/mL，改变 EV 溶液的用量，试验了 EV 对体系 RRS 强度的影响如图 4 所示。由图可知，当 2.010-4 mol/L 的 EV 溶液的用量为 0.6 mL 时，体系的 IRRS 值最大且恒定。3.2.3 反应速度及其稳定性在室温下，实验了试剂空白的 RRS 强度 I0RRS 随时间的变化如表 1 所示，由表 1 可知，DS 与 EV 在 15 min 内即可反应完全，瑞利散射强度 IRRS 达最大，此后，缔合物体系 IRRS 至少在 4 h 基本不变。实验选择反应时间 15 min 后进行测定。表 1 时间的影响Tab.1 Effect of time时间/min510152030 60120240300IRRS607.3624.7628.7638.4644.3643.6646.9633.8589.13.2.4 离子强度的影响加入强电解质 NaCl考察了离子强度对体系RRS散射强度的影响。结果表明，试剂空白的RRS强度I0RRS 受离子强度的影响很小，而离子缔合物的RRS强度IRRS 在 cNaCl 0.02 mol/L时基本不变，但进一步增大 NaCl 的浓度时，随离子强度增加，体系变得不稳定，随时间变化，IRRS 降低。3.2.5 表面活性剂的影响 实验了浓度为 0.01% 的非离子表面活性剂：聚乙烯醇（PVA）、阳离子表面活性剂：溴化十六烷基吡啶（CPB）、阴离子表面活性剂：苯磺酸钠（SDS）对体系共振瑞利散射的影响。实验发现，体系的 IRRS 几乎不随着 PVA 用量的增大而改变。但随着 CPB 用量的增大，体系的 IRRS 先增大后减小，分界点为 0.3 mL。对于 SDS 来说，单是试剂空白就产生了强烈的峰信号，说明 EV 与 SDS 生成新的缔合物。3.3 共存物质的影响按 2.2 实验方法，考察了共存物质对 DS-EV 体系共振瑞利散射测定 1.0 g/mL DS 的干扰情况如表 2 所示。结果表明，当测定误差小于 +5% 时，共存物质的允许量（以 g 计）如表 2 所示：表 2 共存物质的影响Tab.2 Effect of coexistent substances干扰离子 最大允许量 干扰离子 最大允许量 干扰离子 最大允许量 / g/mL / g/mL / g/mL肌 醇 12000 Cl- 800 Ca2+ 75葡萄糖 7000 L-脯氨酸 500 I- 30麦芽糖 6000 L-色氨酸 500 Mg2+ 30尿素 4500 L-苯丙氨酸 400 NH4+ 30亮氨酸 4500 SO42- 400 Zn2+ 20硼砂 4000 烟酸 300 溶菌酶 10甘氨酸 1500 DL-天冬酸 200 Fe3+ 10乳糖 1500 淀粉 100 Cu2+ 5柠檬酸钠 1200 注： Fe3+ 的允许量较小，加 1.5 mL 3.0 mgmL-1 的焦磷酸钠溶液掩蔽，可使 Fe3+ 允许量提高至 10 倍。可见，方法有良好的选择性。4 工作曲线在确定的最佳反应条件下，取不同量的 DS 标准溶液，按 2.2 实验方法绘制工作曲线如图 5 所示。由图可知，DS 的浓度在 01.6 g/mL 范围内与体系的相对 RRS 强度 (IRRS) 呈线性关系，线性回归方程为：I531.85c+74. 22，相关系数 r 为 0.9980，其检出限 (3) 为 5.0 ng/mL。图 5 DS溶液的标准曲线Fig.5 Standard curve of DS3.5 分析应用3.5.1 血清中硫酸皮肤素含量的测定21取正常人的血清 2.0 mL ，加入 3.0 mL 甲醇，再离心 15 min （4500 r/min）即可将蛋白质分离完全，吸取上清液 1.0 mL 稀释至 25.0 mL。取 1.0 mL 血样与 10.0 mL 比色管中，按 2.2 实验方法测定 DS 含量，并用标准加入法检验了方法的相对标准偏差（RSD）和回收率，结果见表 3 。表 3 血清中 DS 的测定结果和回收率Tab.3 Results for the determination of DS in blood项目 W1 / g/mL W2 / g/mL W/ g/mL RSD / % 回收率 / %血清 1.0 不存在 0.99 0.97 1.00 2.2 98.7 0.97 1.01 0.98注：W1：加入量 ，W2：原有量 ，W：测得总量。3.5.2 尿样中硫酸皮肤素含量的测定取新鲜的正常人尿样，过滤除去尿样中杂质，然后取 1.0 mL 尿样于10.0 mL 比色管中，按 2.2 实验方法测定 DS，并用标准加入法检验了方法的相对标准偏差（RSD）和回收率，结果见表 4 。表 4 尿样中 DS 的测定结果和回收率Tab.4 Results for the determination of DS in urine项目 W1 / g/mL W2 / g/mL W / g/mL RSD / % 回收率 / %尿样 1.0 不存在 0.98 0.99 0.97 2.1 98.0 0.98 0.98 0.98注：W1：加入量 ，W2：原有量 ，W：测得总量。结论：在弱酸介质中，乙基紫与硫酸皮肤素作用形成大分子缔合物，导致溶液共振瑞利散射大大增强并产生新的 RRS 光谱，其最大散射峰位于 498 nm 处。据此建立了一种测定痕量的硫酸皮肤素的新方法。该方法简单，快速和灵敏度高，可用于血清和尿样中硫酸皮肤素的测定，结果令人满意，具有较好的应用前景。参考文献1 Kuiper G.R,The Atmospheres of the Earth and planets 2nd M.Ed,Chicago,Univ.of ChicagoPress, Chap.12.2 Anglister J , Steinberg I Z. Depalarized rayleigh light scattering in absorption bands measured in lycopene solutionJ. Chem Phys Lett ,1979 , 65 : 50-54.3 Nelson W H , Howard W F , Pecora R. Use of ligand probes in light scattering 3 preresonance-enhanced depolarized rayleigh scattering of dibenzoylmethane and selected diorganotin( ) complesesJ. Inorg Chem , 1982 , 21 : 1483-1486.4 Pasternack R.F.,Bustamante C.,Collings P.J.,et al Porphyrin assemblies on DNA as studied by a resonance light-scattering technique J. J. Am. Chem.Soc., 1993, 115: 5393-5399.5 Pasternack R.F,Collings P J,Resonance light scattering: a new technique for studying chromophore aggregation RF Pas