DNA琼脂糖凝胶电泳原理.doc

琼脂糖凝胶电泳进行DNA/RNA定量原理DNA（RNA）定量 分析可用紫外光谱分析，原理是DNA（RNA）分子在260 nm处有特异的紫外吸收峰，且吸收强度与DNA(RNA)的浓度成正比。此外，还可通过琼脂糖凝胶电泳上显示的DNA（RNA）带的亮度来分析，因为EB 作为一种荧光染料，能插入DNA(RNA)的碱基对平面之间而结合于其上，在紫外光的激发下产生荧光，DNA(RNA)分子上EB的量与DNA分子的长度 和数量成正比。在电泳时加入已知浓度的DNA（RNA）Marker作为DNA（RNA）分子量及浓度的参考，样品DNA(RNA)的荧光强度就可以大致 表示DNA（RNA）量的多少。这种方法的优点是简便易行，可结合琼脂糖凝胶电泳分析DNA(RNA)样品的完整性来进行，缺点是不太准。琼脂糖凝胶的配制 根据所需凝胶的浓度秤取琼脂糖，加入相应电泳缓冲液中，用微波炉加热煮沸至琼脂糖完全溶解，加入适量EB混匀，适当冷却后倾入凝胶铸槽中，插入梳子，凝胶厚度不超过梳孔，如有气泡产生则用玻璃棒驱除，不能过早拔除梳子，应待凝胶完全凝结后才能拔除梳子。 3P1、P2、P3的配制P1的配制：在800ml去离子水中溶入Tris碱6.06g，Na2EDTA?2H2O3.72g，用HCl调整pH至8.0，用去离子水调整容积至1升，每升P1内加入RNaseA100mg。 P2的配制：在950ml去离子水中溶入NaOH8.0g，20SDS50ml，调整容积至1升。 P3的配制：在500ml去离子水中溶入醋酸钾294.5g，用冰醋酸调整pH值至5.5，用去离子水调整容积至1升。 4常用缓冲液： TE pH7.4 10mmol/LTris?Cl（pH7.4） 1mmol/LEDTA（pH8.0） pH7.6 10mmol/LTris?Cl（pH7.6） 1mmol/LEDTA（pH8.0） pH8.0 10mmol/LTris?Cl（pH8.0） 1mmol/LEDTA（pH8.0） STE（亦称TEN） 0.1mmol/LNaCl 10mmol/LTris?Cl（pH8.0） 1mmol/LEDTA（pH8.0） STET 0.1mmol/LNaCl 10mmol/LTris?Cl（pH8.0） 1mmol/LEDTA（pH8.0） 5%TritonX-100 TNT 10mmol/LTris?Cl（pH8.0） 150mmol/LNaCl 0.05%Tween20 电泳缓冲液 Tris-乙酸（TAE）：50浓贮存液（每升）：242gTris碱 57.1ml冰乙酸 100ml0.5mmol/LEDTA（pH8.0） 使用时再稀释50倍。 Tris-磷酸（TPE）：10浓贮存液（每升）：108gTris碱 15.5ml85磷酸（1.679g/ml） 40ml0.5mmol/LEDTA（pH8.0） 使用时再稀释10倍。 Tris-硼酸（TBE）：5浓贮存液（每升）：54gTris碱 27.5g硼酸20ml0.5mmol/LEDTA（pH8.0） 使用时再稀释10倍。 碱性缓冲液：1使用液（每升）：5ml10mol/LNaOH 2ml0.5mmol/LEDTA（pH8.0） Tris-甘氨酸：5浓贮存液（每升）：15.1gTris碱 94g甘氨酸（电泳级）（pH8.3） 50ml10%SDS（电泳级） 2SDS凝胶加样缓冲液 100mmol/LTris?HCl（pH6.8） 200mmol/L二硫苏糖醇（DTT） 4%SDS（电泳级） 0.2溴酚蓝 20甘油 30丙烯酰胺： 将29g丙烯酰胺和1gN,N亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中，加热至37溶解之，补加 水至终体积为100ml。用Nalgene滤器（0.45孔径）过滤除菌查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中 保存于室温。 10mol/L乙酸铵： 把770g乙酸铵溶解于800ml水中，加水定容至1L后过滤除菌。 1mol/LCaCl2： 在200ml纯水中（Milli-Q水或相当级别的水）溶解54gCaCl2?6H2O，用0.22滤器过滤除菌，分装成10ml小份贮存于20。 2.5mol/LCaCl2： 在20ml蒸馏水中溶解13.5gCaCl2?6H2O，用0.22滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于20。 1mol/L二硫苏糖醇（DTT）： 用20ml0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09gDTT，过滤除菌后分装成1ml小份贮存于20。 0.5mol/LEDTA（pH8.0）： 在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na?H2O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0，然后定容至1升，分装后高压灭菌备用。 溴化乙锭（10mg/ml）： 在100ml水中加入1g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。 1mol/LMgCl2： 在800ml水中溶解203.3gMgCl2?6H2O，用水定容至1升，分装成小份并高压灭菌备用。 酚：氯仿： 把酚和氯仿等体积混合后用0.1mol/LTris?Cl（pH7.6）抽提几次以平衡这一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆盖等体积的0.01mol/LTris?Cl（pH7.6）液层，保存于4。 磷酸缓冲盐溶液（PBS）： 在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4，用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水定容至1升，高压蒸汽灭菌20min。保存于室温。 乙酸钾溶液（用于碱裂解）： 在60ml5mol/L乙酸钾溶液中加入11.5ml冰乙酸和28.5ml;水，即成钾浓度为3mol/L而乙酸根浓度5mol/L的溶液。 3mol/L乙酸钠（pH5.2和7.0）： 在800ml水中溶解408.1g三水乙酸钠，用冰乙酸调节pH值至5.2或用稀乙酸调节pH至7.0，加水定容至1升，分装后高压灭菌。 1mol/LTris： 在800ml水中溶解121.1gTris碱，加入浓HCl调节pH至所需值。 pHHCl 7.470ml 7.660ml 8.042ml 应使溶液冷至室温后方可最后调定pH值，加水定容至1升，分装后高压灭菌。 Tris缓冲盐溶液（TBS）： 在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl和3gTris碱，加入0.015酚红并用HCl调pH值至7.4，用蒸馏水定容至1升，分装后在15lbf/in2（1.34105Pa）高压下蒸汽灭菌20分鈡，于室温保存。 5mmol/LNH4Ac溶液： 秤取乙酸铵192.7g，加重蒸水250ml混匀，加重蒸水定容至500ml，1.1kg/cm2灭菌20min。 10mg/mlBSA（小牛血清白蛋白）溶液： 秤取100mg小牛血清白蛋白溶于10ml灭菌重蒸水中。置4冰箱贮存备用。 10%十二烷基硫酸钠（SDS）： 在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，加入水定容至1L，分装备用琼脂糖凝胶电泳缓冲液的配制 实际工作中常用的缓冲液配制见表琼脂糖凝胶电泳缓冲液配方 a.TBE浓储存液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温条件下用玻璃瓶保存5X溶液，出现沉淀后则予以废弃。以往都以lX作为使用液(即1：5稀释浓储存液)进行琼脂糖凝胶电泳。但05X的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖凝胶电泳都以1：10稀释的储存液作为使用液。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳使用的lXTBE，是琼脂糖凝胶电泳时使用液浓度的2倍。聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小，通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用1XTBE以提供足够的缓冲容量 b.碱性电泳缓冲液应现用现配 在配制缓冲液时，不论哪一种都需要加适量的EDTA，以除去2价金属离子。另外，硼酸与琼脂糖易形成复合物，使凝胶带负电荷，可能会吸附带正电荷的物质。 琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下：1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液. 2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加 1TAE电泳缓冲液至没过胶板为止. 3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序). 4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. (5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min. (6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存琼脂糖凝胶电泳步骤2006-10-24 17:21a)用高压灭菌指示纸带将洗净、干燥的玻璃板的边缘(或电泳装置所配备的塑料盘的开口)封住，形成一个胶模。将胶模放在工作台的水平位置上(用水平仪校正)。b)配制足够用于灌满电泳槽和制备凝胶所需的电泳缓冲液（通常是1x TAE或0.5xTBE)。在已加有一定量的电泳缓冲液的三角锥瓶或瓶盖未拧紧的玻璃瓶中加入准确称量的琼脂糖粉。缓冲液不宜超过锥瓶或玻璃瓶的50容量。c)在锥瓶的瓶颈上松松地塞上Kimwipes纸。如用玻璃瓶，瓶盖须拧松。在沸水浴或微波炉中将悬浮液加热至琼脂糖溶解。d）用融化的琼脂糖封住边界。e）在合适的位置上放置核子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。如果梳子距玻璃板再近，则拔出梳