毛鹃菌根真菌多样性初步研究-硕士论文

分类号 河南农业大学硕士学位论文 密级 论文题目： 垂鹃菌根真菌多搓! 眭塑生研究 英文题目：区堡型S 地亟YQ n 丛Y 堡Q 丛h i 圣鱼! 鱼坠g 丛曼Q i y 曼坠i 鲤Q f R h o d o d e n d r o n p u l c h r u m 学位申请人：杨县 导师：王趑量4 教援 韭查墓直级王程短 专业： 园挞植堑生理赏园茎 研究方向： 园挞植物遗佳直叠： 论文提交 日期： 学位授予 日期： f f I l J i l l f lr li l ll itI IF i l lH f Y 17 2 8 7 7 9 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 学位 文题目t毛鹃菌根真菌多样性初步研究 级别 硕士 学生学科 导师 姓名 杨兵园林植物与观赏园艺王献副教授 专业 姓名 学位论文 是否保密 如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 特此声明。 研究生签名：扬暑导师签名：蜊 日期：加矽年石月争日日期：死归年月尹日 ， 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离 开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单 位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农 业大学所有，否则，承担相应的法律责任。 一 、 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 一 ” 、 ， 研究生签名：杨墨、导师签名：王献。学院领导签名：O - ： 日期：孙年6 月争日日期：撕g 月坪日 日期：年月日 致谢 在论文即将完稿的瞬间，我激动万分，三年来经历的人和事，让我获益匪 浅。在这里，我要感谢在此期间帮助过我的人。 首先要感谢的是我的导师王献副教授，三年来，王老师严谨的治学精神，渊 博的学识，以及平易近人的为人态度，使我终生受益。我也非常感激王老师给我 到上海市园林科学研究所实习科研的机会，使我感受到了大都市学术气氛的浓 郁，学术水平得到了较大提高，值此论文完成之际，向王老师表示衷心的谢意! 陈延惠老师在论文初稿完成以后，对我的文章提出了修改建议和意见，使论文更 加科学和严谨，在此表示衷心感谢! 论文得以顺利完成，还得益于我的另一位恩师上海市园林科学研究所高 级工程师张春英老师。张老师严谨求实的治学态度和高度敬业的精神对我触动很 大，培养了我科学严谨的求学态度。张老师在实验过程中悉心指导，诲人不倦， 使我的实验操作技能和动手能力有了很大的提高，独立思考问题能力也有了很大 提升。在生活上张老师也给予了我无微不至的关怀，使我在异乡感受到了家的温 暖。 我还要感谢尹丽娟、陈伟峰师姐和王际振、周喜军师兄，总能在我遇到实验 难题的时候给予无私的帮助，使我的实验能够顺利进行。还有师弟翟帅，张辉和 师妹尹纯丽在实验中也给予了我很大的协助。另外，我还要感谢上海市园林科学 研究所给我提供实验场所和设备，以及科研所的老师们，尤其是罗玉兰老师在我 实验过程中的帮助。感谢实验室的学长学姐、学弟学妹，和我在实验室度过的每 一天；感谢我宿舍的兄弟们，在日常生活中无私的帮助；感谢我的同门刘亚琼和 同学乔俊鹏、于红芳、万慧敏等在我不在校期间不厌其烦地代我办理一些手续和 杂事，让我得以顺利毕业。 最后，我要由衷的感谢我的父母对我的鼓励、关心、爱护，给予我生活上和 精神上的大力支持，他们的恩情无以回报。 再次感谢帮助过我的老师、同学、朋友、亲人，祝福你们永远幸福、安康! 杨兵 2 0 1 0 年5 月于郑州 毛鹃菌根真菌多样性初步研究 目录 目录 摘要l 1 文献综述2 1 1 菌根研究进展2 1 1 1 菌根概念和种类2 1 1 1 2 内生菌根：j ：2 1 1 2 菌根多样性研究3 1 1 3 菌根的功能4 1 2 杜鹃花类菌根研究进展5 1 2 1 杜鹃花类菌根侵染范围及形态特征5 1 2 2 杜鹃花类菌根效应研究6 1 3 分子技术在菌根真菌多样性研究中的应用8 1 3 1 R A P D 随机扩增多态性D N A ( R a n d o mA m p l i f i e dP o l y m o r p h i s mD N A ) 8 1 3 2P C R 。R F L P 。8 1 3 ：；A F L P 8 1 3 4 简单序列重复( S i m p l es e q u e n c er e p e a t ，S S R ) 8 1 3 5 简单重复序列区间分子标记( I n t e rS i m p l eS e q u e n c eR e p e a tI S S R ) 9 1 3 6I T S 及其引物9 2 引言l l 3 不同杜鹃花样地菌根感染率的比较研究1 2 3 1 材料与方法一1 2 3 1 1 材料1 2 3 1 2 试验方法1 2 3 2 结果与分析一1 3 3 3 小结1 4 3 3 1 自然生境中毛鹃菌根侵染率1 4 3 3 2 菌根侵染率相关因素1 4 4 毛鹃根系内生菌资源调查及多样性分析1 5 4 1 毛鹃菌根分离菌株的形态多样性研究1 5 4 1 1 试验材料15 4 1 2 培养条件。l5 4 1 3 方法一l5 4 1 4 结果与分析。1 6 4 2 毛鹃菌根分离菌株的遗传多样性研究1 8 4 2 1 试验材料l8 4 2 2 试验方法l8 4 2 3 分子多样性的结果与分析。1 9 4 3 小结2 6 4 3 1 毛鹃菌根的形态多样性2 6 4 3 2 毛鹃菌根的遗传多样性。2 6 5 结论。：2 8 参考文献2 9 英文摘要3 5 毛鹃茵根真菌多样性初步研究 目录 图版及图版说明3 7 I I 毛鹃菌根真菌多样性初步研究摘要 摘要 杜鹃花( R h o d o d e n d r o ns p p ) 是主产我国的重要观赏植物类群，园林和花卉园艺应用上 都具有很高的价值。毛鹃( R h o d o d e n d r o n p u l c h r u m ) 俗称毛叶杜鹃，是杜鹃花科的重要 观赏类型，在上海的公园、街头绿地等应用广泛。但最佳观赏性表现一般在栽培后的1 - 3 年，以后就逐渐表现出不同程度的衰退现象。杜鹃花类菌根( E r i c o i d m y c o r r h i z a s ，E R M ) ， 亦称为欧石楠类菌根，对杜鹃花科植物的营养吸收、重金属污染的缓解和植物的生长发育 等方面都具有非常重要的促进作用。为了探究杜鹃花( R h o d o d e n d r o ns p p ) 生长势衰弱的 原因及为复壮技术准备基础资料，本研究对上海及周边地区栽培毛鹃的菌根侵染率和菌根 真菌多样性进行研究，并获得了大量的E R M 真菌资源，为进一步开发、应用菌根真菌打 下了基础。论文通过对毛鹃( R h o d o d e n d r o n p u l e h r u m ) 分离菌根的形态及遗传多样性等方 面的研究，获得了以下主要结论： 1 对采自3 个地区的毛鹃菌根( r h o d o d e n d r o nm u c r o n a t u mm y c o r r h i z a ) 进行了菌根侵 染率检测，发现3 个地区的菌根侵染率差异不大，绝大部分为2 级侵染级别，侵染率在 2 0 2 5 之间，只有上海地区的园科所样地和植物园样地侵染率超过了2 6 ，为3 级侵染， 表明在自然环境下，毛鹃根系的侵染程度并不很高，菌根侵染率受一定程度立地条件的影 响。 2 使用马丁孟加拉红培养基和M M N 培养基作为分离培养基，从3 个分布区分离出了 3 6 6 个菌株，并通过形态分类与I T S R F L P 分子标记相结合的方法，将其分为1 9 类。数据 分析发现，3 个地区的毛鹃菌根分离真菌都具有丰富的资源，并且大部分菌株类型在不同 样地间存在一致性，7 0 以上的菌株类型为2 个以上的样地共有；同时，每个样地也具有 自己的独特类型，表现出较明显的趋异性。 3 对挑选出的5 0 个菌株进行了基因组D N A 提取，I T S 区段的序列扩增和测序，根据 r D N A I T S 序列比对和B o o t s t r a p 检测结果：毛鹃菌根分离真菌的主体仍是子囊菌，其 r D N A I T S 序列与已知分离菌株序列相似性为8 9 一9 9 ，1 9 个R F L P 类型中，有9 个类型， 即4 7 的类型，为尖孢树科尖孢树属植物的内生真菌；8 个未知子囊菌类型；2 个未知类型。 关键词：杜鹃花类菌根；毛鹃；E R M 真菌多样性；r D N A I T S 序列 毛鹃菌根真菌多样性初步研究文献综述 1 文献综述 土壤中某些真菌与植物根能形成互利共生的结合体，称之为菌根。凡能引起植物形成菌 根的真菌称之为菌根真菌。菌根能促进寄主植物对营养元素的吸收利用、促进植物生长，提 高植物品质，增强寄主植物的抗逆性等作用。菌根生物技术在解决土壤干旱贫瘠及荒山造林 等方面也有重要作用。菌根技术研究越来越受到科研工作者的重视，发展前景广阔。 1 1 菌根研究进展 一 1 1 1 菌根概念和种类 1 8 8 1 年，F M Ka m i e n s k i 就曾提出菌物可能给植物的生长提供水分，而植物又给菌物 提供代谢营养的论点，但并未引起广泛关注。随后关于菌根方面的研究日益增多，在1 8 8 5 年，德国植物病理学家A B F r a n k 正式提出了菌根( M y c o r r h i z a ) - - 词：菌根是自然界中一种普 遍的植物共生现象，它是土壤中的一类真菌与植物根系所建立的互惠共生体，而参与菌根形 成的真菌被称为菌根菌( 蔡磊等，2 0 0 1 ) 。 菌根现象广泛存在于大自然中，据估计地球上大约有9 0 以上的高等植物与菌根菌都 能形成共生关系( S m i t hSE 等，1 9 9 7 ；阎秀峰等，2 0 0 2 ) ，在生态系统中发挥着重要的功能 ( H a r l e y 等，1 9 8 3 ；朱教君等，2 0 0 3 ) 。菌根种类丰富，分类标准不同，则结果不一。H a r l e y ( 1 9 8 9 ) 将菌根分为外生菌根( E c t o m y c o r r h i z a 或E c t o t r o p i cm y c o r r h i z a , 简称E C M ) ，丛枝 菌根( V Am y c o r r h i z a e ) ，内外生菌根( E c t e n d o m y c o r r h i z a s ) ，兰科菌根( O r c h i dm y c o r r h i z a ) ， 浆果鹃类菌根( A r b u t o i dm y c o r r h i z a ) ，水晶兰类菌根( M o n o t r o p o i dm y c o r r h i z a ) 和欧石楠 类菌根( E r i c o i dm y c o r r h i z a ) 等7 类。大致可以分为三类，即外生茵根( E c t o m y c o r r h i z a 或 E c t o t r o p h i cm y c o r r h i z a ) 、内生菌根( E c d o m y c o r r h i z a 或E n d o t r o p h i cm y c o r r h i z a ) 及内外生菌根 ( E c t e n d o m y c o r r h i z a 或E c t o e n d o t r o p h i cm y c o r r h i z a ) 。 1 1 1 1 外生菌根 真菌的菌丝大部分着生在幼根的表面，少量菌丝侵入到皮层细胞间隙中，被侵染的植株 根毛不发达，菌丝替代了根毛的作用，如松、苏铁、山毛榉科、桦木科植物等。 1 1 1 2 内生菌根 内生菌根的特点是真菌的菌丝体主要存在于根的皮层细胞间和细胞内，共生的植物 仍保留有根毛。大多数农作物、木本植物和野生草本植物均具有内生菌根，但由于缺乏 明显的外部形态特征而常不为人们重视。丛挂萱握( a r b u s c u l a rm y c o r r h i z a lf u n g i ) 又 称泡囊一丛枝菌根( V e s i c a l a r A r b u s c u l a r ) 即V A 菌根，是常见的内生菌根，是内囊霉 科( E n d o g o n a c e a e ) 的部分真菌与植物根形成的共生体系。 1 1 1 3 内外生菌根 是内生和外生菌根的过渡类型，并且兼具两者的一些特征。对其共生的真菌总体知之较 少，主要分布于森林土壤中。 2 毛鹃菌根真菌多样性初步研究文献综述 1 1 2 菌根多样性研究 1 1 2 1 形态多样性 菌根是一些高等植物根系与真菌所形成的互惠共生体，形态多样性极其丰富。菌根形 态不同，形态差异巨大，并且由于菌根真菌、寄主植物和环境条件的不同，即使亲缘关系较 近或类型相同的菌根，形态也会存在较大的差异( 张春英，2 0 0 8 ) 。 外生菌根( E C M ) 具有真菌组织缠绕形成的菌套( M a n t l e ) 、菌丝进入皮层细胞间隙形 成的哈蒂氏网( H a r t i gn e t ) 、根外菌丝和菌索( R h i z o m o r p h a e ) ( S m i t ha n dR e a d ，1 9 9 7 ) 。 由于寄主植物不同，形成的E C M 在形态上差异较大。如桦木( B e t u l a c e a e ) 及松科( P i n a c e a e ) 树种菌根多为二叉分支；壳斗科( F a g a c e a e ) 树种则形成塔装菌根；杨属( P o p u l u s ) 和桉 属( E u c a l y p t u s ) 树种常形成单轴状菌根。不同菌根真菌形成的菌根形态多种多样，如绒白 乳菇常常形成塔形菌根；土生空团菌等形成的菌根呈二叉状、珊瑚状或疣状；而西澳粘滑菇 和黄口蘑多形成羽状菌根。这一形态特点为菌株类型识别提供了参考。 内生菌根可分为无隔膜内生菌根( A s e p t a t e e n d o t r i p h i cm y c o r r h i z a ) 和有隔膜内生菌根 ( S e p t a t e e n d o t r i p h i cm y c o r r h i z a ) 。丛枝菌根( a r b u s c u l a rm y c o r r h i z a ，A M ) 在自然界中分 布广泛，是与植物关系极为密切的内生菌根。能与绝大多数的高等植物形成共生体系。被 A M 真菌侵入、扩展形成菌根后的植物根系，外部形态很少或几乎没有发生变化，用肉眼很 难看出是否为A M 菌根。只有少数受侵染的植物根系颜色可能略微有所不同。在显微镜下可 观察到A M 真菌侵入点、根内菌丝、根外菌丝及其与菌丝相连的厚垣孢子等( 刘润进和李晓林， 2 0 0 0 ) 不同属A M 真菌所形成的菌根形态各异，如A c a u l a s p o r a , E n t r o p h o s p o r a , G l o m u s 和 S c l e r o c y s t i s 属的真菌在根内可形成丛枝和泡囊结构：而G i g a s p o r a 和S c u t e l l o s p o r a 属只形成 丛枝但在土壤中形成辅助细胞另外A M 真菌孢子大小、颜色、壁的层次、连孢菌丝等形态 差别很大，种属间孢子果形成与否以及孢子果的形态也各有特点并且即使亲缘关系很近的 菌株在菌落形态上也会表现一定的差异。比如云锦杜鹃根系内生真菌分离中也发现类似的情 况，分子鉴定都属于O i d i o d e n d r o ns p ，而菌落形态出现较大差异( 张春英，2 0 0 8 ) 。可见， 慎重对待每一个形态特征非常重要 内外生菌根是具有外生菌根和内生菌根两者特征的一类特殊菌根。它既能像外生菌根形 成哈蒂氏网和菌套，又可像内生菌根深入到根系细胞中，形成不同形态的菌丝圈和隔膜，但 无丛枝和泡囊结构。浆果鹃类菌根兼具E C M 的一些形态和A M 的部分特征如P i 1 i t h t i n c t o r i a s 侵染植物根系即能形成羽状分支的复合结构，又能形成哈蒂氏网；而有的真菌侵染不能形成 哈蒂氏网或只能形成薄薄的一层，比如尸b i c o l o r 形成的菌根。水晶兰类菌根则同时具有菌套、 哈蒂氏网和胞内菌丝圈。有的菌套多层较厚，内部结构紧密。可由哈氏网和菌套侵染形成“真 菌钩”的独特结构。 1 1 2 2 菌根真菌的物种多样性 形成菌根的真菌种类丰富，据调查大约有5 0 0 0 至U 6 0 0 0 种真菌形成外生或内外生菌根( 石 毛鹃菌根真菌多样性初步研究文献综述 兆勇等，2 0 0 3 ) 。诸如粮食作物、油料作物、园艺作物( 果树、蔬菜、花卉) 等都具有丛枝 菌根；森林树木都形成外生菌根。因此，这两种菌根是分布最广的菌根类型( 刘润进等，2 0 0 0 ) 。 C h e n 等调查了我国南方1 5 个桉树人工林，分离出1 7 种E C M 真菌，隶属于1 0 个属，具有丰富 的多样性。北京东灵山地区E C M 真菌有3 0 属1 5 2 种，占该地区大型真菌种类的4 5 9 ( 石兆 勇等，2 0 0 3 ) 。到目前为止，世界范围内已报道的A M 真菌新种1 7 4 个，其中五梗囊霉素3 4 个，原囊霉属3 个，内养囊霉属5 个，巨孢囊霉属9 个，球囊霉属9 3 个，类球囊霉属2 个，盾巨 孢囊霉属2 8 个。这一数目比1 9 8 8 年S c h e n c k 和P e r e z 的统计结果增加了5 0 个( 盖京苹等，2 0 0 5 ) 。 S c h e n c k ( 1 9 8 7 ) 等调查了未开发的荒草林地和耕作土壤中A M 真菌孢子的种类和数量，发现 荒草林地中孢子数量较少，种类多；耕作土壤中孢子数量较多，种类少。由此可见不同生态、 不同寄主植物和不同季节条件下A M 真菌物种多样性存在差异( 石兆勇等，2 0 0 3 ) 。 据文献记载，兰科植物菌根菌种类设计4 个门、7 J b 纲、1 4 个目、5 0 个属( 朱国胜等，2 0 0 4 ) 。 在新加坡，T h a m 从1 2 种兰科植物根围鉴定得到8 7 种菌根真菌分泌物，而澳大利亚、意大利、 加拿大和日本等国也已获得很多兰科菌根真菌。浆果鹃类和水晶兰类菌根也具有丰富的物种 多样性。M a t s u d a 等( 2 0 0 1 ) 在日本中部5 个森林中调查发现有2 9 种不同类型的水晶兰类菌根 真菌。 1 1 3 菌根的功能 1 1 3 1 扩大寄主植物根系的吸收面积 无论是外生菌根还是内生菌根，除一部分真菌菌丝在根表形成菌丝套或进入根皮层细胞 内形成泡囊丛枝外，还有大量的菌丝伸展在植物根系土壤中形成密集的菌丝网，可代替植物 根毛吸收养分，扩大植物根系对养分的吸收面积，增强寄主植物从土壤中吸收各种矿物质营 养的能力( 蒋家淡等，2 0 0 1 ) 。 1 1 3 2 促进寄主植物对营养的吸收利用 菌根真菌能分解土壤中的有机质，加速土壤养分循环，改良土壤结构，提高土壤中养分 的有效性。其对土壤中磷的吸收改善作用最为明显。一般情况下，土壤中几乎9 5 - - 9 9 的 磷是以不可给状态存在，不能直接被植物吸收利用。菌根真菌产生磷酸酶，使不可给态磷转 化为可给态磷，并以聚磷酸盐颗粒状态储藏在菌丝的液泡内，供给寄主植物利用。由于菌根 真菌的活动直接或间接地影响植物的根际环境，而根际环境又影响根际微生物种类和活性， 进而影响寄主植物的养分吸收( 徐冰等，2 0 0 0 ) 。菌根真菌还能增加对c u 、z n 等微量元素的 吸收。 1 1 3 3 菌根真菌能产生生长激素 菌根真菌能产生各种植物生长刺激素，如：细胞生长素、细胞分裂素、赤霉素、维生素、 生长调节素、吲哚乙酸等，这些生长激素在形成菌根之前就能对植物的生长发育起刺激作方 用，从而促进植物生根、萌发和生长( 唐明娟等，2 0 0 0 ) 。 4 毛鹃菌根真菌多样性初步研究文献综述 1 1 3 4 加强寄主植物的生物保护作用 在外生菌根的表面具有紧密交织的菌丝套，皮层组织内部又有哈蒂氏网，根部致病菌必 须穿过菌丝套和哈蒂氏网能侵入到皮层组织和分生组织内部产生病害，所以外生菌根对致病 菌的侵入可起到一种屏障作用；另一方面，有些菌根真菌还产生抗生物质，抑制病菌生长发 育，还有些菌根真菌能寄生在致病菌上形成重寄生，病菌被溶解或被杀死。A a r x 认为，外生 菌根对寄主营养根的生物保护作用是菌根生态作用的最重要的一个方面，建议把外生菌根作 为生物防治根部病害的手段。研究认为，外生菌根菌对植物根部病原菌的拮抗作用优于世界 公认的生物防治剂( 蒋家淡等，2 0 0 1 ) 。 1 1 3 5 增强寄主植物的抗逆性 菌根不仅能促进植物的生长发育，还能够增加抗旱性。A l l e n ( 1 9 8 0 ) 认为，干旱地区 的菌根能增加植物抗旱性和提高水分的传递速率。B e t h e n d a i v a y ( 1 9 8 8 ) 认为，菌根的作用 可改善土壤结构以及提高土壤持水量，从而提高植物对水分的吸收利用。菌根还可提高宿主 抗盐碱、抗极端温度、湿度及p H 值的能力。同时，菌根真菌可以产生玉米素、赤霉素、吲 哚乙酸等生长调节物质，刺激植物生长，也可产生抗生素抑制病原菌的生长，调节根部微生 物环境等( 弓明钦等，1 9 9 7 ) 。 1 2 杜鹃花类菌根研究进展 杜鹃花类菌根，亦称为欧石楠类菌根，是指杜鹃花科几个属植物根系上形成的菌根，是 内生菌根中的一个特殊类型，在杜鹃花类植物的生长发育中扮演着重要角色。 1 2 1 杜鹃花类菌根侵染范围及形态特征 R a y n e r 在1 9 1 5 年发现了杜鹃花科植物的根皮层细胞被菌丝结( c o i l ) 占据，H a r l e y ( 1 9 6 9 ) 把这种特殊的菌根共生结构命名为杜鹃花类菌根( E r i c o i dM y c o r r h i z a ，简称E C M ) ，杜鹃类 菌根的形成是菌根真菌对成长新根的侵染。主要发生在杜鹃花科杜鹃属( R h o d o d e n d r o n ) 、 欧石楠属( E r i c a ) 、帚石楠属( C a l l u n a ) 、越橘属( V a c c i n i u m ) 、马醉木属( P i e r i s ) 、山月 桂属( K a l m i a ) 、喇叭茶属( L e d u m ) 、木梨栌属( L e u c o t h o e ) 、白树属( G a u l t h e r i a ) 和 梅樱属( P h y l l o d o c e ) 等的吸收根上。杜鹃花科植物的根通常是细弱的须根，包括1 层表皮细 胞，1 2 层皮层细胞和纤细的中柱。菌根在结构上与未侵染的须根差异不大，用肉眼很难发觉， 只是菌根成熟的表皮和皮层细胞内含有菌丝或菌丝节，但没有菌套，也没有哈蒂氏网，很少 有胞间菌丝。 由于进化历程和生存条件的差异，不同寄主植物或环境条件的不同，杜鹃类植物菌根的 形态结构具有多样性。同一植物有的是内生菌根，有的则是外生菌根，或是内外生菌根。即 使是同一种植物的不同植株，菌根的形态也不尽相同。由此可见杜鹃花类菌根真菌形态的丰 富性，因此在菌根的形态分类和种类鉴定方面还有大量的工作要做。 5 毛鹃菌根真菌多样性初步研究文献综述 1 2 2 杜鹃花类菌根效应研究 1 2 2 1 菌根菌促进杜鹃花科植物营养吸收的研究 在自然条件下，杜鹃花科植物生长的适宜p H 是4 0 5 5 ，影响了根系对土壤中氮的吸 收。S t r i b l e y 和R e a d 对蔓越橘接种菌根真菌，并向土壤中施入标记”N ( N r t 4 ) S 0 4 ，结果表明，接 种处理比未接种处理植株中N 含量明显增加，”N 的原子数比未接种的低。经土壤分析，只 有少部分”N 与土壤中的有机质结合，说明菌根菌促进了越橘根系对土壤中的有机N 吸收 ( S t r i b l e y 等，1 9 7 4 ) 。R e a d ：g 芋接种后的杜鹃花科植物( E r i c ab a u r e r a ) 幼苗和未接种的幼苗共同 种植在N 供应过量的土壤中，一段时间后移栽到沙中并供应缺乏N 素的营养液4 周，每隔一周 收获一次并测定两种植株中的N 含量，发现未接种的植株中N 的含量在移栽后持续下降，而 接种的植株中N 含量在4 周内维持在原有水平。通过数据分析，可知菌根能获取并储存N ，在 寄主缺氮时为植株提供氮源( R e a d ，1 9 8 7 ) 。 菌根菌还可以促进杜鹃花科植物对磷的吸收。M i c h e l l 和r e a d 在沙培中供应l m g L 有机P 时发现，接种菌根菌的蔓越橘生长和植株产量比未接种的高( 李亚东等，1 9 9 6 ) 。杜鹃花类 菌根真菌也能够从有机磷源中获得磷营养，H e r i c a e 在以D N A 作为磷源比以正磷酸盐为磷 源时菌丝产量高( L E A K EJR ，e t a l1 9 9 6 ) 。除了P 和N 外，菌根菌可以促进杜鹃花科植物对 其它元素的吸收。P o w e l l 等研究证明，接种菌根菌的高丛越橘比未接种的枝条中s 和C a 含量 分别增加了4 7 和1 4 ( P o w e l l ，C L 1 9 8 3 ) 。 1 2 2 2 菌根菌对重金属污染的缓解作用 菌根菌能促进寄主植物对营养元素的吸收，并能对重金属元素如F e ，P b ，C u ，Z n 等供 应过量时减轻其毒害作用。拟欧石楠能在含有多种金属的土壤环境中生长，并且相关试验也 证明拟欧石楠在工矿污染严重土壤和铜污染土壤中样能良好生长( M A R R sRH ，1 9 7 8 ) 。在 铜污染和镍污染土壤上栽培拟欧石楠与其他杜鹃花科植物的试验研究证明，其具有在金属污 染土壤中生长的能力( M O N N ISe t a l ，2 0 0 0 ；M O N N IS , e t a l ，2 0 0 0 ) 。关于菌根对重金属元素 的吸收的抵抗机理，L e v i t t 认为可能是由于接种菌根菌后寄主具有了抵抗重金属元素在植物 体内积累或排除重金属元素的能力( L e v i t t ，J ，1 9 8 0 ) 。 1 2 2 3 菌根真菌对杜鹃花科植物生长的影响 菌根真菌对杜鹃花科植物吸收养分的影响最终反映在植株生长效应上。S t r i b l e y 采用沙 培试验进行研究证明，接种菌根菌的杜鹃花植物植株的干重比未接种菌根菌的植株增加很多 ( S t r i b l e y 等，1 9 8 0 ) 。J o h n 等用H e r i c a e 和S v a c c i n i i 矮丛越橘接种后，植株生长旺盛，分 枝增加，枝条长度明显增加。P o w e l l ( 1 9 8 2 ) 用He r i c a e ( P e z i z e l l ae r i c a e ( R e a d ) ) 接种 高丛越橘促进了植株生长，植株干重增加了。可见，菌根菌对杜鹃花科植物生长的影响具有 非常重要的促进作用。因此，对菌根菌的分离和培养研究非常必要，具有重大的实践应用意 义。 6 毛鹃菌根真菌多样性初步研究文献综述 1 2 2 4 杜鹃类菌根菌多样性研究状况 C o v i l l e ( 1 9 1 0 ) 首先观察到高丛越橘根系中有菌根真菌寄生，并推测菌根真菌的侵染可 能对越橘有益。D o a k ( 1 9 8 2 ) 从杜鹃花科的根中分离出内生真菌，并且通过回接确定这一 菌根菌的类型。F r e i s l e b e n ( 1 9 3 3 ，1 9 3 4 ，1 9 3 6 ) 从越橘中分离出了菌根真菌，发现分离出的菌 根真菌与包括越橘在内的大多数杜鹃花科植物有共生关系( 李亚东等，1 9 9 6 ) 。从杜鹃花科 植物中分离并鉴定为杜鹃花类菌根菌的真菌种类都属于子囊菌类。最常见分离出的菌根真菌 类型是盘菌类场册P ，z 卯办螂e r i c a e ( R e a d ) K o r f & K e m a n ，属于锤舌菌属，最初I 扫R e a d 命名 为P e z i z e l l ae r i c a e 。很多杜鹃花科植物根系都可分离出这种共生真菌，包括马醉木( P i e r i s f l o r i b u n d aL ) 、沙龙白珠树( G a u l t h e r i as h a l l o nP u r s h ) 、杜鹃花( R h o d o d e n d r o no b t u s u m v a r k a e m p f e r iG ，D o n 和肋o d o d e n d r o nl o c h a eF 九础、越桔( V a c c i n i u ma n g u s t i f o l i u mA i t ) 根 中分离出的共生真菌柱顶孢( S c y t a l i d i u mv a c c i n i iD a l p e , L i t t e n & S i g l e r ) ，其菌丝特征与H e r i c a e 非常相似，后被鉴定为H e r i c a e 的无性型。D a v i di M i d g l e y ，S u s a nM C h a m b e r sa n dJ o h n w G C a i m e y ( 2 0 0 4 ) 从W o o l l s & p u n g e n sC a r ( M u e l l ) 和L e u c o p o g o n p a r v i f l o r u s ( A n d r ) 两种 植物的根系中分离到了3 2 7 种内生真菌，并根据真菌侵染寄主根系的I T S 序列和r D N A 基因片 段设计特定引物，最后用P C R 和R F L P 技术鉴定出这些杜鹃花科菌根真菌几乎均属于子囊菌 类。因此真菌H e r i c a e 应该是杜鹃花广谱性根系内生菌根真菌。 另一类常分离出的杜鹃花类菌根真菌类型是丝孢菌类的树粉孢属( O i d i o d e n d r o n ) ，如 0 m a i u sb a r r o n 、O p e r i c o n i o i d e sm o r r a l l 和O g r i s e u mr o b a k 等，它们与杜鹃花科的多种植物 形成菌根( S t e i n k ee ta 1 ，19 9 6 ；M c l e a ne ta 1 ，19 9 9 ；M o n r e a le ta L ，19 9 9 ；J o h a n s s o n ，2 0 01 ；B e r t he t a 1 ，2 0 0 2 ；U s u k ie ta 1 ，2 0 0 3 ；B o u g o u r ea n dC a i m e y ，2 0 0 5 ) 。树粉孢属真菌是杜鹃花科植物根系中 常见的共生真菌，但不同植物根系中菌根类型并不相同，如从杜鹃花( R h o d o d e n d r o ns p p ) 植物中分离出的树粉孢属多为0 m a i u s 的菌株，而从越桔根系中分离的真菌没有O m a i u s 的菌 株，而是树粉孢属真菌内其他类型的菌株。 砖隔腔菌( C a p r o n i as p ) 的一些菌种从沙龙白珠树根中分离出来，并且为菌根菌群体优 势菌株，回接能形成典型的杜鹃花类菌根( B e r c he ta 1 2 0 0 2 ；A l l e ne ta 1 ，2 0 0 3 ) 。从杜鹃花科植 物中分离出来，并且无菌培养条件下形成了菌根的还有皮盘菌科( D e r m a t e a c e a e ) 菌种类型 ( U s u k ie ta 1 ，2 0 0 3 ；B o u g o u r ea n dC a i m e y ，2 0 0 5 ) 。这些真菌实验证明其属于杜鹃花类菌根菌， 但是其功能还不清楚。类似瓶霉属( P h i a l o p h o r a ) 的一些种类也从杜鹃花科植物中分离出来， 人工条件下也形成了菌根，但并不形成胞内典型菌丝节，所以这类真菌是否属于杜鹃花类菌 根真菌还有争议。 存在争议的还有担子菌。P e t e r s o n 等( 1 9 8 0 ) 在杜鹃花菌根解剖结构研究中从菌根提取 D N A 进行菌种I T S 片段分子鉴定，结果表明担子菌是主要的杜鹃花类菌根菌类型( B e r c he t a 1 ，2 0 0 2 ；A l l e ne ta 1 ，2 0 0 3 ) ，如S e b a c i n as p p 的一些菌株。但是至今人工培养没有分离出担子 菌类型( B e r g e r e ta 1 ，2 0 0 0 ；B e r t he ta 1 ，2 0 0 2 ；A l l e ne ta 1 ，2 0 0 3 ) ，也没有关于共生性研究的进一步 7 毛鹃茵根真菌多样性初步研究文献综述 报道，因此担子菌在杜鹃花类菌根菌中的作用与地位目前还不能确定。 一些共生真菌类从杜鹃花科植物根中分离出来，并且回接成功，但是很难进行菌根真菌 类型鉴定( B e r c he ta 1 ，2 0 0 2 ) 。还有些菌根菌在培养条件下能与杜鹃花植物根形成类似菌丝节 结构，但却分离自非杜鹃花科植物。作者在毛鹃的菌根分离培养试验中发现分离菌株形态类 型丰富，但多数类型不能产生孢子，单从形态上进行菌株类型鉴定，难度较大。因此，菌类 的分类鉴定还需要多种方法的结合，要从菌株的形态学、生理生化和分子水平多方面进行研 究、比较、相互补充，以求获得一个相对有效、简便、快速的分类方法，才能使杜鹃花科菌 根真菌研究得到更深入的发展。 1 3 分子技术在菌根真菌多样性研究中的应用 目前杜鹃花科菌根真菌的分类和鉴定主要还是依靠传统的形态分类鉴定方法，依据菌根 真菌子实体的形态学、解剖学等特征来进行鉴定。但菌根真菌在不同生长阶段、不同生活环 境中其形态变异较大，这给菌根菌的分类鉴定及多样性研究带来了障碍。因此，杜鹃花科菌 根真菌的分类和鉴定在采用传统方法的同时，还应采用D N A 分子标记技术( 包括P C R 、R F L P 、 R A P D 、A F L P 技术) 、同工酶分析技术等分子生物技术作为辅助手段，更好地促进人们对菌 根菌的进一步了解。 这些新技术表现出了巨大的优越性，使菌根真菌的鉴定再不受其生长阶段和形态的限 制，以此有助于对根部菌根真菌侵染的鉴定和定量分析，从而提高了菌根真菌鉴定的准确性， 是对形态分类方法的必要补充。 1 3 1 R A P D 随机扩增多态性D N A ( R a n d o mA m p I f i e dP o I y m o r p h i s mD N A ) R A P D 是利用随机引物对基因组D N A 进行扩增，由于引物在D N A 模板上的结合位点不 同，从而可以扩增出不同长度的多态性片段。R A P D 技术需要D N A 量少，揭示的多态性高， 因而广泛用于微生物群体鉴定、分类、系统演化、遗传标记等方面的研究( 张斌等，2 0 0 7 ) 。 1 3 2P C R 求F L P P C R R F L P 也称为酶切扩增片段多态性序歹U ( C l e a v e da m p l i f i e dp o l y m o i p h i cs a q u e r c e ， C A P S ) 。它是一种哇t P C R 和R F L P 相结合的技术。广泛应用于真菌的系统发育( p h y l o g e n y ) 和分 类学( t a x o n o m y ) 研究中( C h e nW ，1 9 9 2 ) 特别在外生菌根真菌遗传多样性研究中成为最常 用的方法之一( 张斌等，2 0 0 7 ) 。 1 3 3A F L P 近年来A F L P 耳P 扩增片段长度多态性( A m p l i f i e dF r a g m e n tl e n g t hP o l y m o r p h i s m ) ，已成 功地应用到真菌研究中( J 叽g h a n se ta 1 ，1 9 9 8 ) 实质上是R F L P 和R A P D - 者的结合。A F L P 标 记多态性高，结果稳定，重复性强，所以有较广阔的应用前景( 张斌等，2 0 0 7 ) 。 1 3 4 简单序列重复( S i n t o l es e q u e n c er e p e a t ，S S R ) S S R 技术是根据微卫星序列两侧的保守序列设计引物，扩增D N A 片段，从而检测出因重 8 毛鹃菌根真菌多样性初步研究文献综述 复次数不同而导致的长度变化的多态性。其主要优点是共显性标记，重复性好，稳定性高( 张 斌等，2 0 0 7 ) 。 1 3 5 简单重复序列区间分子标记( I n t e rS i 呻I eS e q u e n c eR e p e a tI S S R ) I S S R 是Z i e t k i e w i c z 等于1 9 9 4 年创建的一种基于P C R 分子标记技术( 周延清，2 0 0 5 ) 。其 基本原理是根据真核生物基因组中广泛存在的简单重复序列设计引物进行P C R 扩增，在生物 的遗传多样性研究中应用广泛( 张斌等，2 0 0 7 ) 。 1 3 6I T S 及其引物 核糖体内转录间隔区( I n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r ，I T S ) 位于r D N A r R N A 片段上，包含 两个不同的非编码区域，E P I T S l 和I T S 4 。真菌核糖体基因( r i b o s o m a l D N A ，r D N A ) 由d , 的亚 单元( 1 8 S ) 、I T S l 区、5 8 S 区、I T S 2 区和大的亚单元( 2 8 S ) 构成，头尾串联形成重复序列。 真菌I T s 区域长度一般在6 5 0 - 一7 5 0 b p ( 碱基对) 。r D N A 多复制的特性，有利于低浓度或被更 高度降解的D N A 样品中I T S 区域的扩增。 r D N A 上的1 8 S 、5 8 S 、2 8 S 和5 Sr R N A 基因有极大的保守性，即存在着广泛的异种同 源性，这对于研究尚无任何r D N A 序列资料的生物来说是非常方便的，可以根据这些基因上 的高度保守区段设计出通用引