脂肪酶的综述.doc

食品与药品 Food and Drug 2007年第 9 卷第 12期 脂肪酶的研究进展张中义，吴新侠 （郑州轻工业学院 食品与生物工程系，河南 郑州 450002）摘 要：对脂肪酶菌种来源、催化活性中心构成对酶活性的影响及工业应用的研究进展作一综述。关键词：脂肪酶；催化作用；应用中图分类号：Q 55 文献标识码： A 文章编号：1672-979X(2007)12-0054-031前景与展望 脂肪酶来源不同，导致结构和性质的多样性、不稳定性，使脂肪酶研究进展较慢。固定化脂肪酶可重复利用，提高酶稳定性、有利于实现工业化生产，降低生产成本。目前，脂肪酶固定化因其经济性和技术可靠性，离产业化还有相当大的差距，需对脂肪酶载体、固定化技术作深入研究。今后，脂肪酶研究需生物遗传、生物化工、仪器分析、食品工程等领的研究人员通力合作，筛选新的工业脂肪酶菌株，以解决工业生产和保护环境问题。2 脂肪酶结构和分子生物学研究2.1 脂肪酶的结构 脂肪酶分子由亲水、疏水两部分组成，活性中心靠近分子疏水端。脂肪酶结构有 2 个特点：（1）脂肪酶都包括同源区段：His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gly或 Y-Gly-His-Ser-W-Gly（X、Y、W、Z 是可变的氨基酸残基）；（2）活性中心是丝氨酸残基，正常情况下受 1个-螺盖保护；（3）多数脂肪酶都有 1 个螺旋片段，一般称为“盖子”,当酶处于闭合状态时，活性位点被“盖子”覆盖。当存在脂质微囊时，“盖子”打开与其结合，催化脂肪水解。Secundo4研3种脂肪酶是：柱状假丝酵母脂肪酶(Candida rugosalipase, CRL),莓实假单胞菌脂肪(Pseudomonasfragilipase,PFL)和枯草杆菌脂肪酶A(Bacillussubtilisli-pase A, BSLA)。用 CRL同工酶 3 代替 CRL 同工酶 1的盖子结构时，脂肪酶在有机溶剂中的活性和立体选择性都有降低。用Thr取代PFL脂肪酶活性中心137位Val和138位Asp，发现PFL 作用于8底物时活性增强。BSLA 无脂肪酶“盖子”结构，将同源脂肪酶“盖子”结构插入 BSLA，其活较插入前降低，底物专一性也发生改变。研究表明，脂肪酶“盖子”结构不仅影响酶活性，而影响酶底物的特异性和稳定性。动物机体内，激素敏感脂肪酶活性受激素调控。Luigi 等5研究发现，激素敏感脂肪酶 N- 末端严格控制着底物与活性部位的结合，即N-末端是脂底物专一性的主要影响因素。用酸热脂环酸芽孢杆菌酯酶（Alicyclobacillusacidocaldariusesterase EST）定向诱变脂肪酶N-末端，实验结果表明，诱变后产脂肪酶突变株催化原来底物，己酸酯催化能力降低数十倍，但催化三酰基甘油酯能力提高 30 倍。研究了3种脂肪酶“盖子”结构对脂肪酶活性和有机溶剂中选择性的影响。2.2 脂肪酶分子生物学研究用基因技术改造脂肪酶部分基因，克隆出多种脂肪酶基因并获得表达。Kohno 等6用错配 PCR 技术，对雪白根霉脂肪酶基因随机突变，酶 C 末端Glu218被Val替代，并在酿酒酵母AH22中表达，可使雪白根霉脂肪酶作用温度由37 提高到50 。酶活性增加110 %韩振林等7首次克隆了铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）脂肪酶基因，测定了核苷酸序列，用基因重组技术构建了脂肪酶基因的表达载体，并在枯草芽孢杆菌中获得表达，表达蛋白质占发酵液总蛋白质的 25 %。3 脂肪酶的应用3.1 脂肪酶在食品加工中的应用 脂肪酶在肉类加工中已得到有效的利用，如鱼肉加工中，脂肪酶参与生物酯解，除去鱼肉的脂类。近年，油脂改良技术成为研究的热点，最有价值的应用是将棕榈油转化为类可可脂。在非水相中用米赫毛霉（Mucor miehe）脂肪酶 Lipozyme IM催化，使硬脂酸甲酯与3339 熔点棕榈油进行酯有催化酯交换改性油脂风味好，异构体少，不产生对人体有害的反式脂肪酸等优点，可生产营养价值高的塑性脂肪。3.2 脂肪酶在奶酪、面包中的应用脂肪酶可用于改良食品风味。 在适当条件下，脂肪酶生成短链脂肪酸酯、乙醇、丙酮、乙醛二甲硫醚及低级脂肪酸等风味成分，增强食品香味。如在奶酪生产中，脂肪酶将脂肪降解为游离脂肪酸，游离脂肪酸分解形成有挥发性的脂肪酸，异戊醛，二乙酰，3- 羟基丁酮等呈味物质，改善了奶酪风味，并产生特殊香味。脂肪酶还能催化脂肪释放1 2，C1 4）脂肪酸产生爽滑感。释放出游离脂肪酸参与化学反应，诱发合成乙酰乙酸、-酮类酸、甲基酮、香味酯和内酯等香味成分9有机溶剂中，南极假丝酵母脂肪酶 B 催化合成短链香味酯转化率较高，现已用作酯化反应的高效催化剂10。用产朊假丝酵母（Candida utilis）发酵脂肪酶处理的牛肉汁或黄油，可产生类似牛肉或蓝纹奶酪的风味物质。脂肪酶还可延长面包的货架期，控制非酶促褐变，增加面包体积，改善面包结构。国外 Bio-CatInc、Enzyme Industry、Troy、VA 等公司已开始销售添加脂肪酶面包的生产设备。3.3 脂肪酶在纺织物中的应用 织物表面脂质影响织物的柔软度、光亮度和着色与手感。传统脂处理法是用化学品脱除，效果不理想，且污染环境，成本高。脂肪酶能将织物表面脂质水解成易溶于水的脂肪酸，易于脱除。EI-Syed等11研究了酶处理羊毛毯的防缩性能，比未处理的羊毛缩水性有明显改善。用脂肪酶和淀粉酶协同处理棉布纤维，棉布白度提高，染色瑕疵少，更柔软、舒适3.4 脂肪酶的医学应用3.4.1 脂肪酶是一种重要的药物靶或中间体标记酶。 作为诊断工具，脂肪酶可预测疾病。测定脂肪酶催=化甘油三酸酯产生的甘油可间接获得血清甘油三酸酯的含量，血清中脂肪酶还可用于检测急性胰腺炎和胰腺损伤。Ahmed13研究了脂肪酶和血清淀粉酶测定胰腺炎的特异性，结果表明，胰腺炎病发后血脂肪酶明显升高，诊断有特异性，结果比血清淀粉酶更可靠。交换，制取类可可脂8此外，脂肪酶在改变植物油物理性状方面也有很大的潜力。3.4.2 研究发现，从蜡蛀虫中提取的脂肪酶或酯酶，对分生杆菌属结核杆菌( M y c o b a c t e r i u mtuberculosis)H37Rv有杀灭作用14提取植物脂肪酶制成的药物，可改善患者的消化吸收功能。美国俄勒冈州健康护理专业研究中心已有脂肪酶类药品上市，用于治疗胃肠紊乱、消化不良等疾病13在手性药物合成中，用脂肪酶制备单异构体手性药物可提高转化率、减少环境污染。3.5 脂肪酶在生物柴油中的应用 生物柴油是碳链长度为1619的脂肪酸和甲醇或乙醇形成的酯类化合物的总称。近年，用脂肪酶催化合成生物柴油，代替石化能源成为研究热点。用物理吸附法将假丝酵母脂肪酶（Candida sp. 99-125）固定于大孔树脂，可催化大豆油制造生物柴油。研究表明，粗酶/树脂重量比为1.92:1，水/ 油重量比为3:17， 40 ，pH 7.4时，脂肪酶活性较高，转化率 9 7 .3% 1 6 用固定化南极假丝酵母（C .antarctica）脂肪酶催化泔水油，可制造生物柴油173.6 脂肪酶在生物传感器中的应用用脂肪酶的催化特性研制生物传感器逐渐受到关注。固定在pH或氧化电极的脂肪酶联合葡萄糖氧化酶可作为脂质生物传感器，测定甘油三酯、血胆固醇含量。2003年第28卷第7期 中国油脂 文章编号:1003)7969(2003)07)0005)06 中图分类 号:TQ641 文献标识码:A 脂肪酶的结构特征和化学修饰 郭 诤1,2,张根旺3(1. 天津大学化工学院生物化工系,300072天津市;2.郑州工程学院化学化工系,450052郑州市嵩山南路140号;3.郑州工程学院食品工程系,450052郑州市嵩山南路140号) 摘要:通过对脂肪酶的氨基酸组成、催化中心的构成特点和晶体结构等最新研究成果的综述,阐明了脂肪酶的结构特征。重点讨论了脂肪酶的化学修饰,尤其是在修饰方法和修饰机理方面的研究进展。并对脂肪酶化学修饰技术在生物技术与食品工程领域的应用前景进行了展望。关键词:脂肪酶;催化三元组;化学修饰;聚乙二醇;活化 脂肪酶(lipase E.C. 3.1.1.3)亦称酰基甘油水解酶(acylglycerol hydrolases),广泛存在于原核生物(如细菌1)和真核生物(如霉菌2、哺乳动物3、物4等)中。脂肪酶的天然底物是甘油酯类,然而研究表明,脂肪酶除了能够催化甘油酯类化合物的水解5和合成6之外,还可以用于催化酯交换反应7、生物表面活性剂的合成8、多肽合成9、聚合物的合成10和药物的合成11等,尤其是利用某些脂肪酶的立体专一性,催化旋光异构体的拆分12和手性药物的合成13成为酶工程领域研究的新热点。因而脂肪酶及其改性制剂在食品与营养、日用化学工业、油脂化学品工业、农业化学工业、造纸工业、洗涤和生物表面活性剂的合成、以及药物合成等许多领域得到广泛应用。脂肪酶在许多领域展现出诱人的应用前景,然而这种催化剂的许多/天然0性质如活性、选择性、稳定性等在多数情况下都不能满足其催化反应的要求,这种基于拓展其应用空间和应用范围的/改进0可以通过化学修饰来实现。对酶的化学修饰的目的有两个:其一是通过对构成酶催化活性中心氨基酸残基的定向修饰,揭示酶的活性中心构成和催化机理3,14;其二是通过对活性中心构成无关的氨基酸侧链的修饰,改善酶原有的催化功能或者创造新的功能15,16。从根本上讲,前者属于一种分析手段;后者则是酶工程研究的主要内容和重要手段。广义而言,凡是对酶的一、二、三级结构的改变都是囊化以及化学键合等)、通过定点诱变或利用克隆技术对酶进行基因修饰和表达17,18、以及对组成酶一级结构氨基酸侧链的修饰都属酶修饰的范畴。毫无疑问,基因修饰能从根本上改变酶的结构,使之满足研究及应用需要,其稳定性和重复性比较好。然而基因修饰投资大、成本高、研究周期长。化学修饰则操作简便、方式灵活、周期短、见效快,是一种颇具实用价值的生物工程技术。关于酶修饰的策略,人们提出了许多新奇的想法并进行了许多大胆的尝试。Mozhaev等19用盐酸胍处理酶使其肽链完全伸展,对酶分子内部的疏水基团进行修饰,然后让它在适当的条件下重新折叠,但未获成功。Saraswathi等20先使核糖核酸酶变性,然后加入丙酸作为酯酶的竞争性抑制剂,再用戊二醛进行表面交联)固定所希望的活性构象,最后透析除去抑制剂。结果创造了一种新的/酸性酯酶0,从而改变了酶的底物专一性,获得了新的酶活力。Kilibanov等21则提出了类似的/生物印迹法0(bio-imprinting),其原理是利用酶在水溶液中的柔性,加入手性竞争性抑制剂,然后将这种酶-抑制剂复合物转入亲脂性溶剂,使酶的三维结构以一种改性的状态被/冻结0,除去抑制剂的改性酶凭借其/记忆0功能就具有了对底物的立体选择性。多数脂肪酶属单链蛋白酶,无辅酶因子。脂肪酶分子的修饰可分为表面修饰和内部修饰22。化学固定化属于借助于某种共价键将酶连接到惰性载体表面的一种修饰方法。小分子修饰是利用小分子化学试剂与酶表面的)COOH、)NH2、)OH、)C6H4OH等反应,如酰化、烷基化、糖基化等。小分子修饰也常常导致酶构象的改变,甚至对底物立体专一性的改变。一些可溶性大分子如PEG、右旋糖酶修饰。因此酶的固定化(物理吸附、包埋或微囊化以及化学键合等)、通过定点诱变或利用克隆技术对酶进行基因修饰和表达17,18、以及对组成酶一级结构氨基酸侧链的修饰都属酶修饰的范畴。毫无疑问,基因修饰能从根本上改变酶的结构,使之满足研究及应用需要,其稳定性和重复性比较好。然而基因修饰投资大成本高、研究周期长。化学修饰则操作简便、方式灵活、周期短、见效快,是一种颇具实用价值的生物工程技术。关于酶修饰的策略,人们提出了许多新奇的想法并进行了许多大胆的尝试。Mozhaev等19用盐酸胍处理酶使其肽链完全伸展,对酶分子内部的疏水基团进行修饰,然后让它在适当的条件下重新折叠,但未获成功。Saraswathi等20先使核糖核酸酶变性,然后加入丙酸作为酯酶的竞争性抑制剂,再用戊二醛进行表面交联)固定所希望的活性构象,最后透析除去抑制剂。结果创造了一种新的/酸性酯酶0,从而改变了酶的底物专一性,获得了新的酶活力。Kilibanov等21则提出了类似的/生物印迹法0(bio-imprinting),其原理是利用酶在水溶液中的柔性,加入手性竞争性抑制剂,然后将这种酶-抑制剂复合物转入亲脂性溶剂,使酶的三维结构以一种改性的状态被/冻结0,除去抑制剂的改性酶凭借其/记忆0功能就具有了对底物的立体选择性。多数脂肪酶属单链蛋白酶,无辅酶因子。脂肪酶分子的修饰可分为表面修饰和内部修饰。2 脂肪酶的化学修饰2.1 小分子修饰 脂肪酶表面暴露有许多游离的羟基、酚羟基、巯基、羧基、氨基等官能团,可以与一些小分子化合物如醛、酮、羧酸等发生烷基化、酰化、醚化等反应。尤其是赖氨酸末端的E)NH2具有较强的亲核性,能够与许多亲电试剂在温和的条件下发生反应,这对在修饰过程中保持酶的活性、减少酶活损失是十分有利的。因此,E)NH2成为化学修饰的首选官能团。1968年Means和Feeney34首先报道了用乙醛和丙酮借助于与氨基形成Schiff碱对蛋白质进行了修饰。Kaimal和Saroja35采用类似的方法,用丁醛、异丁醛和丙酮对猪胰脂酶进行了化学修饰,结果发现修饰后脂肪酶的Vmax提高了50%,催化水解和酯化的活性都有所提高,而酶原有1,3-专一性未受影响。用5-磷酸吡哆醛修饰CCL赖氨酸残基、用二硫苏糖醇还原其二硫键得到的结果都表明36,修饰后的CCL催化酯化活性有较大提高而水解活性不受影响。Basri等37利用氨基酯的盐酸盐使CRL发生脒化反应,引入了疏水的长链烷基,大大改善了脂肪酶在有机溶剂中的溶解度和热稳定性,催化酯化反应的活性有很大提高,但水解活性有所下降。Tsuzuki等38在RDL(Rhizopus delemar lipase)上引入双十二烷基葡萄糖基谷氨酸而得到的修饰脂肪酶,除热稳定性有所提高外,对长碳链甘三酯的催化专一性增加,但与游离酶相比,易受钙离子的抑制。经过活化的脂肪酸可以在温和的条件下与赖氨酸残基的E)NH2发生酰化反应,从而在脂肪酶侧链偶联上不同链长的脂肪酸,进而改变酶的理化性质和催化活性。如图5所示39,40,脂肪酸的主要活化方法有3种39,40:制备成酰氯的形式、制成琥珀酰亚胺的形式、制成对-二甲硫苯酚酯的形式。酰氯制备方法简单但反应剧烈、修饰过程中易造成酶的失活;对二甲硫酚酯反应条件温和,但成本较高,琥珀酰亚胺是常用的修饰方法。1993年,Murakami39利用对-二甲硫基苯酚酯(DSP,Dimethylsulfoniophenyl ester)于温和条件下在酶上引入了脂肪酸,这种脂肪酸修饰的脂肪酶在正己烷等有机溶剂中催化酯化反应的能力优于天然酶,而且改变了天然酶对不同底物的亲和力(即改变了脂肪酸与酶结合的特异性),这种改变与引入的脂肪酸相关。2.2 PEG化修饰聚乙二醇或甲基聚乙二醇(monomethoxy)polyethylene glycol,(M)PEG有一系列不同分子量分布的产品(常用的分子量分布在5 00010 000之间),无毒副作用,无免疫原性,具有良好的生物相容性。1977年Abuchowski等41率先用PEG修饰牛血清蛋白BSA(bovine serum albumin),发现PEG化的BSA保持了蛋白质的原有活性,在体内的半衰期大大延长,且无免疫原性。其后人们利用PEG化技术先后对大量的蛋白和酶制剂进行了修饰,PEG化的药物能大大延长其在体内的半衰期进而延长药物作用时间、减少服药次数。部分PEG化的药品已获美国食品与药物管理局(FDA)批准上市。 综上所述,脂肪酶的化学修饰不仅在研究酶活性中心的结构,揭示酶结构与其生物学功能之间的关系等方面起着重要作用。而且在提高酶的稳定性、延长半衰期、提高其催化活性、强化或改变其催化的专一性、甚至创造新的功能、扩大酶的工业应用等方面也有着十分重要的意义。然而,必须看到与基因修饰和酶工程相比,其局限性是显而易见的。而且,目前的研究主要局限于酶侧链的修饰,在蛋白质一级结构的修饰、化学突变、肽链展开后的修饰等方面进行的研究工作较少。因此,在弥补上述不足的基础上,如何寻找新的专一性更强的修饰剂,使化学修饰在生物技术领域发挥更重要的作用,是今后研究中应重点解决的问题。第35卷第4期 2005年12月 工业微生物 Vol.35 No.4 Dec. 2005 脂肪酶活力测定研究进展郑 毅, 叶海梅, 周 , 吴朝娟, 吴松刚 (福建师范大学生物工程学院,福州350007)摘 要 脂肪酶催化作用发生在油-水界面上,是一种典型的界面酶,因此其活力测定有别于其他的水相酶。如何准确测定酶活力的大小,对于研究该酶的特性及应用具有重要的意义。本文对脂肪酶检测的常用方法进行了综述与评价。关键词:脂肪酶; 活力测定; 方法 脂肪酶(Lipase EC3.1.1.3.,甘油酯水解酶)是一类水解油酯的酶类。脂肪酶的水解底物一般是天然油脂,其水解部位是油脂中脂肪酸和甘油相连接的酯键。不同于其它水解酶,脂肪酶催化作用系统是一种非均相体系。水溶性的酶催化作用发生在水不溶性底物和水的界面上。这种界面上的催化作用机制仍不甚清楚,不能简单用Michaelis-Menten学说解释酶与底物间的反应机制。有人提出了脂肪酶在油)水界面上定位的假设,提出了/超底物0的模型,该模型能解释脂肪酶的一些行为,但还需要进一步的实验证明和修正。此外,脂肪酶兼具有逆向催化甘油和游离脂肪酸合成甘油脂活性1。 由于脂肪酶独特的催化特性,活力测定具有以下特点:(1)方法的多样性;(2)测量过程影响因素的复杂性;(3)酶活力定义的混乱性。本文对脂肪酶活力测定方法及影响因素进行综述。 测定脂肪酶的方法可分三类:(1)通过测定底物的减少来度量酶活的大小;(2)测定产物增加判断酶活的大小;(3)其他方法。1 测定底物的减少量1.1 浊度测定法 固体测定体系:在制作琼脂平板时加入脂肪酶的底物及有色指示剂。在琼脂平板上点上待测脂肪酶(打孔加样或滤纸片点样),在脂肪酶水解作用下,加样点的周围出现透明圈(或颜色褪去)。根据透明圈(或褪色圈)的大小及透明(或褪色)程度用于判断脂肪酶的活性大小。此法主要于定性,例如产脂肪酶微生物的筛选、脂肪酶活性的初步判断等,如果用于定量,那么就应采用标准活性酶在同一测定平板中进行对照测定,才可消除测定的系统误差2。 液体测定体系:甘油三酯和水制成的乳胶,因胶束对入射光的吸收或散射具有乳浊性状,当胶束中的甘油三酯在脂肪酶催化转变为甘油和脂肪酸,导致胶束分裂,悬液散射光或浊度下降。通过检测甘油三酯乳化液在340nm或365nm的吸光度随时间的降低,来测定酶活力的大小。例如英国RANDOX公司提供的试剂盒,其主要成分是:tris缓冲液(26mmol/L,pH 9.2)、去氧胆酸钠(35 mmol/L)、氯化钙(4 mmol/L),三油酸甘油酯(0.3 mmol/L),co-lipase(3 mmol/L),同时还备有脂肪酶标准液。该方法的缺陷是早期反应阶段的非线性及其线性范围有关,同时为了获得准确可靠的数值,用纯的脂肪酶溶液作标准曲线是必要的。目前该方法已成功用于血清脂肪酶的测定3,4。 另外一种浊度分析法是以吐温20溶液为底物同时溶液中含有CaCl2,通过监测500nm光密度的变化,测定酶活的大小。其原理吐温20溶液中的脂肪酸水解释放出来并以钙盐的形式沉淀下来,从而改变溶液的光密度。这种浊度分析法已成功检测从Chro-mobacterium viscosum(87IU.mg-1)和Candida cylin-dracea(0.5IU.mg-1)中提取出来的脂肪酶活性5。1.2 Wilhelmy平板法 通过检测界面张力的变化来测定脂肪酶的活力及动力学特征67。利用检测界面张力的仪器,将脂类的单分子层膜在液相表面展开,通过探头铂板由电子微平衡仪表感知表面张力的变化。如在液相中加入待检测的脂肪酶,由于脂肪酶的催化作用产生的可溶性的产物,由此必然造成了界面张力的变化,从而推断脂肪酶的活力大小及动力学特征。 该法适用于研究脂肪酶作用于气液界面上油膜的反应。这种方法具有高灵敏度,只要很少量的油脂就能准确地反映出动力学上的变化。但是受到设备及制作脂类单分子层的限制,这种很少推广使用,此外研究气液界面上的油膜的特性是否能够真正反映油水界面性质仍然不得而知。1.3 原子显微镜 Nielsen等人.用原子显微镜法(AFM)在液相研究磷脂酶A2水解磷脂双分子层的动力学特征。随后又成功应用该法研究Humicola lanuginose脂肪酶(HLL)水解酰基甘油/磷脂混合双分子层,其原理是利用AFM可以检测因酶作用而造成双分子层中的缺口8。1.4 红外线光谱学法 Walde和Luisi发展了傅立叶转换红外线光谱法(FTIR)。其原理是通过记录反应混合物的红外光谱特性来了解整个的脂解过程。脂肪酸酯和脂肪酸各具红外光谱吸收峰为1751cm-1和1715 cm-1,因此采用该方法来度量酶活性9。2 测定酶解产物的增加量 根据底物进行脂肪酶活力测定主要有两大类:一类是天然油脂,最常用到是橄榄油;另一类是人工合成的特殊底物,往往这些底物在脂肪酶的催化下会生成含特殊吸色基团的产物,因此采用分光光度法,快速方便测定进程。2.1 以天然油脂为底物 天然油脂在脂肪酶催化作用下,主要产生两种产物脂肪酸与甘油,因此通过检测这两种产物的生成速率,即可反映脂肪酶的催化活力。2.1.1 测量产生的脂肪酸方法2.1.1.1 滴定法 脂肪酶作用于橄榄油乳化液,催化酯键水解,生成脂肪酸,用酚酞为指示剂,用标准NaOH溶液滴定脂肪酸,根据NaOH的用量来计算脂肪酶活力10。滴定法是经典方法,其缺点:(1)由于采用橄榄油乳化液为底物,显乳白色会干扰酚酞的变色,影响终点的判别;(2)反应体系含有缓冲液,产生的脂肪酸为弱酸,会影响中和滴定11。2.1.1.2 测pH值法 基于脂肪酶水解释放脂肪酸导致反应液pH降低,采用pH电极监测,用标准NaOH进行滴定检测12。具体有两种作法:(1)通过pH电极监测脂肪酶催化水解过程,连续滴定中维持的同一pH;(2)脂肪酶催化反应终止后,用pH计代替酚酞监测中和滴定过程,从而测定反应过程中的脂肪酸生成量。前一种方法最大优点是始终维持反应体系中的pH,有利于酶的稳定催化pH环境,同时测量过程不用终止反应过程,因此测量速度较快,但该反应需要高灵度的pH计,同时可自动滴定。根据作者实践,pH计使用受诸多因素影响,例如测量环境的温度影响pH电极受油脂污染灵敏下降等。2.1.1.3 测脂肪酸比色法 Duncombe13提出利用生成的脂肪酸与铜离子形成铜皂,用有机溶剂萃取后,加入铜的呈色剂,在波长为440nm处测定吸光度,计算得出脂肪酸浓度。由于该法检测过程中需要大量的苯进行铜皂的萃取,容易造成污染和对人体造成伤害11,因此目前使用该方法的人很少。 Hirayama和Matsuda阐述用罗丹明6G(一种荧光染色剂)与脂肪酸结合成复合物。该复合物可用正已烷萃取获得。脂肪酸存在时,复合物红色会加深,并可在波长为513nm时读出它的吸光度,从而计算出脂肪酸浓度14。利用此方法可以进行在平板检测产脂肪酶的微生物。在琼脂平板中含甘油三酯和罗丹明B,如微生物产生脂肪酸水解底物后用紫外线照时,可在菌落周围看到橙色光环。根据光环的大小可初步判断微生物产脂肪酶的能力。2.1.1.4 酶偶联法 (1)酶偶联比色法,常用有:(1)以1,2-二亚麻酸甘油酯为底物,脂肪酶催化水解得亚麻酸和2-亚麻酸甘油酯。亚麻酸经B-氧化及酶偶联系统产生NADH,NADH的增加可由分光光度法在340nm处检测出,以此确定脂肪酶的活性15。(2)以三油酸甘油酯为底物,水解产生油酸,油酸被酶偶联生成CoA,再被乙酰CoA氧化酶氧化辛二酰CoA与H2O2,在过氧化物酶作用下与氨替吡啉产生红色反应,可用分光光度法在546nm处测定3。 (2)酶偶联电极法,以甘油三亚油酸被水解成1,2-甘油二亚油酸酯及亚油酸,而亚油酸被脂氧化酶氧化成亚油酸- H2O2时用的氧量,可用氧电极测量,从而测定酶的活性3。 酶偶联法所涉及的步骤较多,需多种酶参与测定过程,同时测定过程需加入共脂肪酶。故应用范围不是很广,主要在医学实验室中采用。2.1.2 测量产生的甘油方法 测定甘油产生的方法并不常用,因为脂肪酶很难同时催化三个酯键生成自由的甘油,无法反映出脂肪酶最初反应速度。主要有三种方法通过估计释放的甘油分子来测定酶活。(1)2-单酸甘油酯为底物,由脂肪酶作用,释放出自由甘油,后者在一系列酶(例如甘油激酶、甘油酸氧化酶和过氧化氢酶)作用下,通过产生吸收峰为550nm蓝色单亚胺苯醌染料而测定16 (2)1-油酰-2,3-二乙酰甘油为底物,经脂肪酶的作用,生成油酸和2,3-二乙酰甘油。后者在二乙酰酶的作用下释放出甘油。甘油在甘油激酶、氧化酶的催化下生成过氧化氢。过氧化氢再在过氧化物的催化下氧化无色染料(LEUCO DRY)成有色染料,可在540nm处测定17。(3)利用荧光素)荧光素酶与甘油形成复合物,利用荧光检测进行测定18。2008 年第33 卷第5期 粮 食 加 工 脂肪酶在食品工业中的应用与研究进展刘海洲, 吴小飞, 牛佰慧, 刘 登, 赵 帅 ( 青岛科技大学化工学院, 山东 青岛 266042)摘 要: 综述了脂肪酶在食品工业领域中的应用与研究进展。脂肪酶在焙烤食品中可作为绿色生物改良剂; 在油脂工业上可促油脂水解、促酯交换和促酯化; 在乳品工业中可用于乳水解; 在食品添加剂中应用可增香改质、提高食品档次。目前国内外还开发出了许多新型脂肪酶产品。关键词: 脂肪酶; 食品; 油脂; 乳品中图分类号: TS 201.2 文献标志码: B 文章编号: 1007- 6395(2008)05- 0055- 03 自 20 世纪 80 年代后期, 界面酶学和非水酶学的研究与应用取得了突破性的进展, 极大地促进了脂肪酶多功能催化作用的开发, 如乳制品的增香、鱼片脱脂、食用油加工、涤剂添加酶、皮革毛皮绢纺脱脂、制药、化工合成、污水处理、工具酶等多种用途。而且, 在有机相中, 脂肪酶还能催化酯合成、酯交换反应、酯聚合反应、肽合成以及酰胺合成等, 是生产医药、化工、食品和化妆品的重要原料。当前, 脂肪酶被广泛应用于工业生产中, 并在基础理论和应用研究中也有十分突出的地位。1 脂肪酶在焙烤食品中的应用 随着焙烤食品工业的快速发展, 消费者的食品安全和健康意识日益增强, 对面粉及其制品提出了愈来愈高的要求。要想生产出好的面粉, 就需要优质的原料, 而我国小麦由于品质参差不齐, 要想达到焙烤食品工业的要求, 就要在面粉后处理中添加食品添加剂, 来弥补面粉品质的不足。过去面包粉改良主要是化学改良剂, 如溴酸钾, 虽然它对面团及面包有较好的作用, 但长期使用对人体有害, 2005 年 7 月 1日被我国禁止使用随着溴酸钾被禁用, 如何使用天然无害具有替代功能的产品, 成为广大焙烤食品及面粉企业关注的焦点, 而生物酶制剂满足了这方面的要求。酶作为一种生物制品, 在面粉改良中, 具有显著的优越性:酶本身就是活细胞产生的活性蛋白质, 不会留下有毒的物质; 酶的催化作用具有高度的专一性, 一种酶只对一种底物起作用, 如淀粉酶只能催化淀粉的水解, 而对蛋白质则无效。酶的催化效率非常高, 比一般催化剂高 1071 013 倍, 因此用量相当少; 酶的操作条件温和, 在常温、常压下就能进行。脂肪酶是酶制剂的一种, 酶的所有特性它都具有, 与其它酶制剂如葡萄糖氧化酶复配后能够取代化学增筋剂溴酸钾。它能够提高面制品的烘焙品质、改善面包质地、延长制品的货架期。2 脂肪酶在食用油脂工业上的应用 脂肪酶可以催化酯交换、酯转移、水解等反应,所以在油脂工业中广泛应用。如 1,3- 特异性脂肪酶可酶促酯交换反应, 将棕榈油改性为代可可酯。代可可酯是生产巧克力的原料, 价格甚高, 而棕榈油价廉, 因此这一工艺受到重视, 已开展了较多工作3 脂肪酶在乳品工业中的应用 应用于乳酯水解, 包括奶酪和奶粉风味的增强，奶酪的熟化、代用奶制品的生产、奶油及冰淇淋的酯解改性等。脂肪酶作用于乳酯并产生脂肪酸, 能赋予奶制品独特的风味。脂肪酶释放的短碳链脂肪酸使产品具有一种独特强烈的奶风味, 而释放的中碳脂肪酸使产品具有皂似的风味。同时, 由于脂肪酸参与到类似微生物反应的过程中, 增加了一些新风味质的形成, 如甲基酮类、风味酯类和乳酯类等。统奶酪制品加工所用的脂肪酶都来自动物组织, 如猪、牛的胰腺和年幼反刍动物的消化道组织, 不同来源的脂肪酶会产生不同风味特征。脂肪酶还可使用在羊奶仿制牛奶的制品中。对不同奶源的奶制品, 脂肪酶的使用可大大改善其原有的不良风味,促使新的风味的产生, 并能改进乳制品的营养价值。脂肪酶在生产酶改性奶酪制品中起关键作用, 酶改性奶酪中含有的游离脂肪酸比只经过普通处理的奶酪中要高 10倍以上, 这对于其作风味增强剂是十分有用。4 脂肪酶在食品添加剂工业中的应用L- 抗坏血酸棕榈酸酯被广泛地用作酯溶性抗氧化剂及营养强化剂。抗坏血酸棕榈酸酯是由 L- 抗坏血酸酯化而得, 同 L- 抗坏血酸相比, 首先, 其抗氧化性有了显著的提高; 其次, 由于棕榈酸基的植入,使得它既有亲水的抗坏血酸基, 又有亲油的棕榈酸基, 从而成为一种优良的表面活性剂; 此外, 它还具有极强的抗癌和抗肿瘤功效。汤鲁宏等对水、庚烷和叔戊醇等几种反应媒体和 NOVO435 (Candidaantartica), MML(Mucormiehei), LIPOLASE, PPL(Porci-ne pancreas) 等数种脂肪酶对 L- 抗坏血酸棕榈酸酯合成反应的影响进行了系统的研究, 结果表明: 反应媒体及脂肪酶品种对反应影响极大, 所研究的几种反应媒体中, 叔戊醇是惟一适用于该反应的反应媒体, 在所研究的几种脂肪酶中, NOVO435 表现出了良好的催化活性。蔗糖月桂酸酯具有乳化、抗菌等功能, 已经引起人们越来越多的关注。越来越多的研究者关注于应用酶作为催化剂区域选择性地合成蔗糖月桂酸酯。第21卷第1期2002年1月 食品与生物技术 Vol.21 No.1Jan. 2002文章编号:1009-038X(2002)01-0094-05收稿日期:2001-05-18; 修订日期:2001-11-24.基金项目:国家/九五0科技攻关项目(96-C03-02-01)资助课题.作者简介:邬显章(1932-),男,江苏无锡人,教授. 脂肪酶分子生物学的研究进展 邬显章1, 邬敏辰2(1.江南大学生物工程学院,江苏无锡214036; 2.江南大学医学系,江苏无锡214063)摘 要:迄今为止已克隆了包括微生物和动植物在内的众多脂肪酶基因,测定了它们的核苷酸序列,从而确定了这些酶的一级结构.作者重点就有关微生物脂肪酶的基因克隆、核苷酸及氨基酸序列分析和基因表达等分子生物学内容作一综述.关键词:脂肪酶;克隆;基因和氨基酸序列;表达中图分类号:TQ925.6文献标识码: AReview of Studies on Molecular Biology of L 脂肪酶(EC 3.1.1.3.)是分解三脂酰甘油的水解酶类,被水解底物三脂酰甘油的醇部分是丙三醇,酸部分为水不溶的12碳以上的长链饱和或不饱和脂肪酸,水解反应发生的部位是三脂酰甘油的酯键.其催化反应如下: 三脂酰甘油+水脂肪酶二脂酰甘油+脂肪酸 其中的二脂酰甘油可被进一步水解为一脂酰甘油、甘油和游离脂肪酸.有关脂肪酶(Lipase)较确切的定义是20世纪70年代由Brockerhoff等首先提出的,他将能水解长链脂肪酸酯或水解油酸酯类的酶类定义为脂肪酶.由于发现该定义易引起脂肪酶和酯酶的混淆,Huang等随即将定义修改为一类能催化特殊类型的酯键即三脂酰甘油的酯键水解的酶;或者从催化作用的可逆性考虑将脂肪酶定义为与高级脂肪酸和丙三醇所形成的三脂酰甘油的合成、转酯和分解有关的酶类;或简言之脂肪酶是催化油酯水解的一类酶的总称.按照国际生化联合会的命名分类原则,脂肪酶编号:EC 3.1.1.3.;系统名称:三脂酰甘油酰基水解酶;习惯名称:脂肪酶.脂肪酶的一个最显著的特点是它不同于其它多数水解酶的催化特性,即该酶催化的水解反应一种非均相体系,水溶性的酶在底物(水不溶性)和水的界面上催化底物反应,对水溶性底物不起催化作用. 微生物脂肪酶作用于底物三脂酰甘油的方式因酶的类型而异.Alford曾比较了23种不同的微生物脂肪酶,发现有3种作用方式类型(见表1),其中,大多数脂肪酶作用于三脂酰甘油的初级位(1,3-位)酯键;但葡萄球菌、黑曲霉和圆弧青霉等脂肪酶无位置专一性,即能水解初级和次级位(2-位)的酯键;白地霉脂肪酶则表现出另一种特殊的专一性,即专一作用于油酸所形成的三脂酰甘油的酯键.近年来,不断有其它底物专一性的脂肪酶被发现,例如,Staphylococcus hyicus脂肪酶偏爱磷脂为底物,也可以水解脂肪酸链长短不一的各种油脂;相反,Staphylococcus aureus脂肪酶专一作用于短链脂肪酸所形成的三脂酰甘油,而中、长链脂肪酸形成的三脂酰甘油以及磷脂很难被水解.1 哺乳动物脂肪酶 从cDNA推导的人胰脂肪酶由465个氨基酸残基组成,其中包括由16个氨基酸残基组成的信号肽4.该成熟蛋白一级结构分别与猪和狗胰脂肪酶有85%和70%的同源性,其中猪和人胰脂肪酶中所有14个半胱氨酸都是保守的;人胰脂肪酶是一种糖蛋白,这与其一级结构在Asn167有一个糖基化位点是一致的,猪和狗胰脂肪酶的两个糖基化位点分别在Asn140和Asn167.人肝脏脂肪酶基因定位在第15号染色体长臂,从cDNA推导的酶蛋白由476个氨基酸残基组成,计算相对分子质量53 249,成熟蛋白N末端前面23个氨基酸组成信号肽.该脂肪酶与哺乳动物肝脏脂肪酶、脂蛋白脂肪酶和胰脂肪酶等有两段相同的疏水结构域:Gly-Tyr-Ser-Leu-Gly和Ser-(X)6-Ser,其中Gly-Tyr-Ser-Leu-Gly被证明是结合脂肪的区域。2 细菌脂肪酶 有关细菌脂肪酶的分子生物学,尤其是假单孢菌属的研究最为深入,已测定了假单孢菌、葡萄球菌、链霉菌和枯草杆菌等众多的细菌脂肪酶基因序列和对应的氨基酸序列,其中某些基因已在相应的宿主中得到了表达.例如:Staphylococcus hyicussubsp hyicus的脂肪酶基因已在Staphylococcuscarnosus和Escherichia coli中进行了表达研究,重组脂肪酶为具有催化活性的胞外酶,克隆的DNA片段长度为2.5 kb,DNA序列分析确定了脂肪酶基因的位置、核糖体的结合位点、信号肽序列以及编码前蛋白1923个核苷酸的开放阅读框,在结构基因的3.末存在3个连续的终止密码子和转录终止信号5;克隆了来源于Staphylococcus aureus的脂肪酶基因,并在Escherichia coli、Bacillus subtilis和S carnosus中获得了表达6;分别克隆了来源于Alcaligenes denitrificans、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonasfragi的脂肪酶基因,并在相应的宿主菌中获得了表达. Pseudomonas alcaligenesM-1产碱性脂肪酶,该酶具有极好地去除脂肪污垢和适合洗涤条件的特性,Gijs等7将该酶的结构基因在各种宿主菌中进行了表达,例如,Bacillus licheniformis、Es-cherichia coli、Streptomyces lividans、Aspergillusniger、Kluyveromyces lactis,但表达量都很低.进一步的研究发现与脂肪酶基因(lipA)相邻被称之为辅助基因(lipB)的DNA片段有关,lipB对lipA的表达、起重要的作用,将lipA和lipB一起克隆到多拷贝质粒pJRD215中,在原宿主菌中进行表达,脂肪酶产量比Pseudomonas alcaligenesM-1提高了近40倍.许多研究人员也发现了这一影响脂肪酶基因表达的辅助基因,分别被称为lipH、limL和lif等.Gijs将P alcaligenes、P aeruginosa、P glumae和P cepacia脂肪酶辅助基因产物的氨基酸序列进