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第32卷 2004年5月 分析化学 FENXI HUAXUE 研究报告 Chinese Journal of Analytical Chemistry 第5期 647 650 荧光素共振光散射法测定脱氧核糖核酸 蔡朝霞 宋功武 3 李 玲 刘立明 湖北大学化学与材料科学学院 武汉430062 摘 要 研究了咕吨类染料荧光素Fluorescein FL 与DNA作用的共振光散射光谱 加入DNA后 在pH 6 8的范围内 荧光素在DNA分子表面发生长距离自组装 在400 nm处产生了增强的共振光散射峰 其发光 强度与DNA的浓度呈线性关系 线性范围为0 04 3 1 mg L 检出限为16 g L 考察了影响因素和最佳 反应条件 建立了用RLS光谱测定ng级DNA的新方法 关键词 荧光素 共振光散射技术 脱氧核糖核酸 2003203217收稿 2003212222接受 本文系中国分析测试基金资助项目 No 992 11 1 引 言 染料与核酸的反应机理以及反应产物结构特征的研究 对于了解核酸生物反应历程 临床医学研究 及核酸的分析测定均有重要的意义 根据染料与核酸的相互作用建立测定DNA的分析方法已有不少 报道 寻求新的简便 灵敏 准确的测定方法仍然是研究的热点 共振光散射法是继光度法和荧光法后 又一简单灵敏的分析方法 Pasternack等 1 用普通荧光分光光度计所建立的共振光散射技术在生物大 分子的识别上出现了丰富而灵敏的信号 表征了分子聚集的光谱特征 目前该技术已经应用于痕量药 物 2 3 表面活性剂 4 测定 童沈阳和李克安等 5 6 在1996年将此技术应用于核酸的分析和研究 从而 开辟了光散射技术在生化分析中的应用 荧光素是一种经典的荧光试剂 具有强的荧光 且荧光激发和发射波长均在可见光区 便于检测 应 用广泛 有关荧光素与DNA相互作用的研究报告并不多 我们曾研究过荧光素与牛血清白蛋白有相 互作用 7 本实验利用共振光散射技术研究发现 荧光素与核酸能够相互作用 并且此分析方法快速 简便 线性范围宽 灵敏度高 测定干扰小 用于合成样品的测定 结果令人满意 2 实验部分 2 1 仪器与试剂 GSP277203磁力搅拌器 江苏秦县医疗器械厂 RF2540荧光分光光度计 日本岛津公司 2 17型 紫外2可见分光光度计 美国P2E公司 PHB24pH计 上海雷磁仪器厂 WH22微型旋涡混合仪 上海沪 西分析仪器厂 用 Tris 三羟甲基氨基甲烷 2HCl缓冲溶液调节pH值 小牛胸腺DNA ctDNA 华美生物工程公司 的操作液浓度为39 mg L 荧光素的操作液浓度为1 0 10 5 mol L 用0 1 mol L的NaCl水溶液控制 离子强度 所用试剂均为分析纯 实验用水均为二次蒸馏水 2 2 实验方法 在25 mL比色管中依次加入0 2 mL荧光素溶液 适量DNA溶液 0 8 mL Tris2HCl缓冲溶液 用 二次蒸馏水稀释至12 5 mL 旋涡混合 放置5 min 将溶液置于 em ex处进行同步扫描 可得共振光 散射光谱 同时作试剂空白 发射和激发狭缝宽度均为10 nm 3 结果与讨论 3 1 光谱特征 按实验方法测得荧光素2DNA体系的共振光散射光谱 RLS光谱 如图1所示 由图1可以看出 图1 共振光散射谱 Fig 1 Resonance light2scattering RLS spectra 1 fluorescein FL deoxyribonucleic acid DNA 2 FL 浓 度 concentration FL 1 6 10 7mol L DNA 1 0 624 mg L 2 0 0 mg L pH 7 5 荧光素本身的RLS信号在400 nm处并不强 但是 加入DNA后 400 nm处出现了增强的共振光散射 峰 其主要原因归结于荧光素在DNA表面分子上 的长距自组装 8 按照实验方法考察了荧光素2DNA体系的紫外2 可见吸收光谱 在200 240 nm附近出现了一宽阔 峰 随DNA浓度的增大 荧光素2DNA体系在230 nm处的吸收峰下降 并发生减色效应 其原因是由 于荧光素在DNA分子表面的聚集 当DNA的浓度 继续增大 吸收峰又开始增大 说明随DNA浓度的 升高 荧光素与DNA的作用经历了由聚集到嵌入的 变化 8 3 2 条件的优化 3 2 1 溶液酸度的影响 按实验方法 以T ris2HCl缓冲 溶液调节溶液的pH 测定不同酸度下的荧光素和荧光素2 DNA体系的RLS强度 其结果如图3 由图可知 荧光素RLS强度随溶液酸度变化很小 而加入DNA后 体系 RLS信号增强 并且随着酸度变化 差值也在变化 当pH值在6 8范围时 体系RLS强度达到最大且保持稳 定 其原因是在中性条件下 DNA的结构没有被破坏所致 本实验选择pH值为7 5 图2 pH值对共振光散射强度的影响 Fig 2 Effect of pH on the intensity of RLS 1 FL DNA 2 FL 浓度 concentration FL 1 6 10 7 mol L DNA 0 64 mg L 图3 变性DNA和天然DNA对体系RLS强度的影响 Fig 3 Effect of denatured DNA and natural DNA on the intensity of RLS 1 天然DNA natural DNA FL 2 变性DNA denatured DNA FL 浓度 concentration FL 1 6 10 7 mol L pH 7 5 3 2 2 Tris缓冲溶液的影响 测定不同体积pH 为7 5的tris溶液对荧光素2DNA体系的RLS强度 的影响 随tris溶液的体积用量的增加 体系的RLS强度不断增强 tris用量为0 8 mL时 强度最大且 稳定 故本实验选择的tris体积用量为0 8 mL 3 2 3 离子强度的影响 以0 1 mol L NaCl溶液控制体系的离子强度 测定体系的 I 当NaCl溶 液的浓度小于0 225 mol L时 体系的RLS强度基本保持不变 随NaCl溶液的浓度继续增加 RLS强 度的变化 IRLS 明显减小 这是由于Na 与核酸上带负电的磷酸基相互作用 削弱了体系的RLS响 应 3 2 4 荧光素浓度的影响 在DNA的测定浓度不超过3 12 mg L 荧光素的用量在1 6 10 7 4 8 10 7 mol L时 体系的共振发光强度线性较好 因此 实验选择荧光素的浓度为1 6 10 7 mol L 3 2 5 DNA热变性的影响 实验研究了热变性DNA 将DNA在沸水浴中加热30 min后迅速放入冰 水浴中冷却10 min以防止其复性 和天然DNA对荧光素的RLS强度的影响 结果见图3 由图3可 846 分 析 化 学第32卷 知 天然DNA明显较变性DNA对体系的RLS强度影响大 这是由于热变性DNA双链解旋而不利于 荧光素与DNA以嵌入方式结合 3 3 共存物的干扰 在0 64 mg L DNA存在下 考虑了多种共存物质对测定的影响 结果见表1 从表1可以看出 在 生理体液中常见的金属离子 如Ca2 和K 和蛋白质 氨基酸以及糖类不干扰测定 说明该方法具有实 际应用价值 由于Ca2 K 和Ba2 等是硬离子 仅与DNA上的磷酸根结合 但软离子 如Sn4 与碱 基结合导致DNA的构象发生严重变化 因而允许浓度很低 表1 干扰成分对测定DNA的影响 Table 1 Interferences of foreign substances 序号 No 干扰成分 Foreign substances 浓度 Concentration mg L IRLS变化 Change of IRLS 序号 No 干扰成分 Foreign substances 浓度 Concentration mg L IRLS变化 Chang of IRLS 1Zn2 1 285 0410Mn2 0 1026 6 2Ca2 102 3311Ag 0 0112 8 3Cu2 0 64 0 7812Cr3 0 646 4 4Br 26 73 413Hg2 0 477 5 5K 10 0 7814Fe3 0 1026 6Ba2 1 280 7815BSA0 00025 3 1 7Pb2 1 280 4716 L2半胱氨酸 L2cysteine 0 003071 55 8Sn4 0 0102 1 917葡萄糖Glucose25 5 1 2 9As5 1 282 8 3 4 工作曲线 在以上确定的最佳反应条件下 绘制了测定DNA的工作曲线 当DNA的浓度为0104 3 1 mg L 时 体系的共振光强度与DNA的浓度呈线性关系 工作曲线的线性拟合方程及相关系数为 I 17 852 9 4322C DNA g L r 0 9972 方法的检出限 3 为16 g L 3 5 合成样的测定 根据表1中共存离子组分干扰允许量配置了3个合成样品 表2列出了合成样品的测定结果 证 明此方法重现性好 结果令人满意 表2 合成样的测定结果 Table 2 Determination result of synthetic samples 样品 Sample DNA的浓度 Concentration of DNA 干扰物质 Foreign substances 测得值 Found mg L 回收率 Recovery CtDNA0 62Zn2 Ca2 Cu2 0 64103 2 CtDNA1 25BSA 葡萄糖 glucose 1 28102 4 CtDNA1 88Cr3 Mn2 1 8698 9 浓度 concentrations CZn2 10 mg L CCa2 5 mg L CCu2 0 05 mg L CBSA 0 02 mg L C葡萄糖 glucose 7 68 mg L CCr3 0 02 mg L CMn2 5 mg L References 1 Pasternack R F Bustamante C Collings P J A m Chem Soc 1993 115 5393 5399 2 Liu S P Luo H Q Li N B Liu Z F Zheng W X A nal Chem 2001 73 16 3907 3914 3 Feng P Shu W Q Huang C Z Li Y F A nal Chem 2001 73 16 4307 4312 4 Liu S P Zhou G M Liu Z F Fresenius J A nal Chem 1999 363 651 654 5 Huang C Z Li Y F Shi Y D Bull Chem Soc Jpn 1999 72 1501 1508 6 Li Z P Li K Tong S Y Talanta 2001 55 4 669 675 7 Song Gongwu 宋功武 Fang Guangrong 方光荣 Zhan Hongju 詹红菊 Chinese J A nal Chem 分析化学 2000 28 12 1565 1566 8 Huang Chengzhi 黄承志 Li Yuanfang 李原芳 Li Nianbing 李念兵 Chinese J A nal Chem 分析化学 1999 27 11 1241 1247 946第5期蔡朝霞等 荧光素共振光散射法测定脱氧核糖核酸 Determination of Nucleic Acid by A Resonance Light2scattering Technique with Fluorescein Cai Zhaoxia Song Gongwu3 Li Ling Liu Liming Faculty of Chemistry and Material Science Hubei University Wuhan430062 Abstract Resonance light2scattering RLS spectra of fluorescein with deoxyribonucleic acid DNA was studied When DNA was added long range assembly of fluorescein on the molecular surfaces of nucleic acid occurred in the pH 6 8 resulted in an enhanced resonance light2scattering peak at 400 nm The intensity of resonance light2scattering was found to be proportional to the concentration of DNA in the linear range of 0104 3 1 mg L and the determination limit 3 is 16 g L The effects of interference substances and optimization of procedure were investigated and a new method for the determination of the DNA at nanogram level based on RLS measurement was established Keywords Fluorescein resonance light2scattering deoxyribonucleic acid Received 17 March 2003 accepted 22 December 2003 中国质谱学会第七届全国会员代表大会暨学术报告会 第一轮通知 由中国质谱学会主办 中国质谱学会第七届全国会员代表大会暨学术报告会预定于2004年8月中旬召开 本次会 议将进行换届选举并在质谱学多个研究领域进行学术交流 邀请知名学者对外质谱学的最新发展动态作专题学术报告 1 会议时间和地点 2003年8月中旬 内蒙古包头市 2 会议费用 注册费 800元 资料费 100元 共900元 会议出版论文集 录用论文将以 质谱学报 增刊形式正式出版 参会论文要求附后 家属注册费700元 免交资料费 3 论文征集内容 1 无机质谱学 2 有机质谱学 3 同位素质谱学 4 生物医学质谱学 5 质谱仪器制造 4 质谱学报 编辑部 联系人 徐书荣 邓中国 通信地址 北京275信箱65分箱 质谱学报 编辑部 邮 编 102413 电话 010 69357734 传真 010 69357285 E mail jcmss401 中国质谱学会办公室 联系人 苏玉兰 通信地址 北京275信箱88分箱