实验和数据分析方法.doc

Agilent 实验原理及步骤一、总RNA抽提（TRIzol法）1. 每2107细胞加入1 ml Trizol，在旋涡震荡器上混匀；对于组织样品，每100mg组织可以加入1 ml Trizol，用液氮研磨或采用电动匀浆器充分打碎组织块。2. 加入约1/5体积的氯仿，上下颠倒充分混匀1 分钟左右，室温下静置5 分钟。3. 4，12,000 rpm 离心15 分钟后小心取出上清液，将上清夜转入新的1.5 ml离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置5 分钟。（15ml离心管用7,500rpm离心20min）4. 4，12000 rpm离心10 分钟后，去上清，向沉淀中加入2/5体积的70% 乙醇， 4，12000 rpm离心洗涤沉淀15 分钟。（15ml离心管用7,500rpm离心20min）5. 去上清，沉淀室温晾干后加入适量无RNA酶的水充分溶解沉淀，测定OD260 和OD280值。 (optional)对于从组织样本抽提的总 RNA，为了更好的去除基因组DNA 的污染，可以采用无RNA 酶的DNA酶I 处理，从而提高样品纯度。二、总RNA质量检测（Lab on chip检测）（一）琼脂糖胶电泳1、配置用DEPC处理的电泳缓冲液50TAE，高压灭菌后待用。2、使用电泳槽前用3%H2O2浸泡15min，然后用DEPC处理的水冲洗，倒入适量1TAE电泳缓冲液。3、称取适量琼脂糖，加入1TAE电泳缓冲液，制备1%的胶（注意使用专用的溶液和相关设备，避免引入外源RNA酶）。4、用专用6Loading buffer做指示剂，取10l上样电泳（电压100伏）15min。5、关闭电源，取出电泳胶，在凝胶成像仪上观测、拍照，保存图像。6、评价总 RNA或 mRNA质量（见FAQ）。通过目测28S和18S的亮度比例可以初步评价总RNA的质量。一般认为28S:18S2可以初步判定总RNA质量较好，如图1所示。 图1 1%agrose胶电泳人胎盘总RNA28S18S （二）Lab-on-chip1、胶制备 取出400l RNA gel Matrix，加入Spinfiter柱子，离心过滤凝胶（1500g， 10min）。2、取出130l过滤胶到1.5mlEppendorf管中，再加入2lRNA Dye Concentrate，在vortexer上振荡混匀。3、用RNA ZAP清洁操作区，同时在Electrode cleaner中加入350lZAP，放入Lab on chip正确位置，合盖清洁探头1min。4、再用另外一Electrode cleaner中加入350lDEPC 处理的H2O,重复步骤3。5、移开Electrode cleaner,让探头自然干燥。6、取出一新的RNA Chip，吸取9l步骤2制备的凝胶加入G 孔中。7、将chip放置于带有活塞（plunger）的水平台上（chip priming station），将plunger拉杆向上拉倒1ml刻度出，再将chip priming station的盖子合上，压紧chip。同时向下推动拉杆至底部并维持30秒左右，松开让拉杆自动弹开。8、从chip priming station上取出chip，用放大镜检查是否有气泡存在，如果在微通道中有气泡，需要重复步骤7。再在标有G的两个孔中各加入9l步骤2制备的凝胶，在标有 的孔中加入5Lrna 6000 Nano Marker。同时在12个加sample的孔中滴加5l RNA 6000 Nano Marker（不能空一个孔）。9、取1l RNA 6000 ladder 滴加到标有 的孔中，再各取1l样品（RNA）加入12个样品孔中，并将chip放入IKA Vortexer上，在set-point振幅处振动1min（注意：必须卡紧chip，否则在振动过程中会跳出来）。10、振荡好后的chip在5min之内必须放入Agilent 2100分析仪上，按照软件提示进行RNA电泳操作。11、评价RNA质量。见（FAQ）如图3所示，为经过Agilent 2100分析得到的完整的人胎盘总RNA。 具体操作步骤参考人cDNA表达谱芯片使用手册,SBC-H-HC-100-22，具体结果见样品质检报告。Lab-on-chip 参照Agilent 2100分析仪操作手册，制备凝胶，按照软件提示进行RNA电泳操作，评价RNA质量。三、总RNA的纯化（QIAGEN RNeasy Mini Kit）如果总RNA的纯度不高，会影响探针的标记效率和芯片杂交结果。所以使用QIAGEN RNeasy Kit纯化总RNA，详细操作原理和方法见RNeasy Mini Protocol。1、取总RNA100 g溶解于100 l RNase free水中，加入350 lBuffer RLT并充分混匀。2、加入250 l无水乙醇，Tip头充分混匀。3、将共计700 l含总RNA的溶液转入套在2 ml离心管内的RNeasy 柱子内，8000 g离心15-30sec，弃去滤过液。4、吸取500 lBuffer RPE到RNeasy mini 柱子内，8000 g离心洗涤1530sec，弃去滤过液，再用500 lBuffer RPE在8000 g离心洗涤2 min，弃去滤过液和2 ml的套管，将RNeasy mini柱子转入一新的1.5 mlEppendorf管中。5、吸取 40 lRNase free的水，8000 g离心洗脱1 min。6、重复步骤5一次。四、cDNA第一链和第二链一步法合成1、 取400ng RNA于1.5ml离心管中，如下配置反应溶液：总RNA 400ngT7 Promotor primer 1.2ulRnase-free Water X ul 总体积 11.5ul2、 65保温10分钟，冰浴5分钟注意：5First Strand Buffer 在使用之前于65保温3-4分钟，并震荡混匀后离心。3、 配置如下cDNA合成体系：5First Strand Buffer 4ul0.1M DTT 2ul10nM dNTP mix 1ulMMLV RT 1ulRNase OUT 0.5ul总体积 8.5ul4、 将上述mix加入变性后冰浴的RNA中混匀5、 40保温2h五、荧光标记cRNA合成1、 cDNA合成结束后将离心管放65保温15分钟。注意：50%PEG使用之前40保温1分钟。2、 如下配置Transcription mix：Rnase-pree Water 15.3ul4Transcription Buffer 20ul0.1M DTT 6ulNTP 8ul50% PEG 6.4ulRnase OUT 0.5ulInorganic Pyrophosphatase 0.6ulT7 RNA Polymerase 0.8ul总体积 57.6ul3、 cDNA产物中加2.4ulCy3/Cy5荧光后混匀。注意：荧光必须先加，然后在加Transcription mix4、 加入57.6ul Transcription mix并混匀5、 40保温2h六、荧光探针纯化将离心机预冷至4（QIAGEN RNeasy Mini Kit）1、反映结束后加入20ul Rnase-free Water, 加入350 lBuffer RLT并充分混匀。2、加入250 l无水乙醇，Tip头充分混匀。3、将共计700 l含总RNA的溶液转入套在2 ml离心管内的RNeasy 柱子内，8000 g离心15-30sec，弃去滤过液。4、吸取500 lBuffer RPE到RNeasy mini 柱子内，8000 g离心洗涤1530sec，弃去滤过液，再用500 lBuffer RPE在8000 g离心洗涤2 min，弃去滤过液和2 ml的套管，将RNeasy mini柱子转入一新的1.5 mlEppendorf管中。5、吸取 30 lRNase free的水，8000 g离心洗脱1 min。6、 吸取20 lRNase free的水，8000 g离心洗脱1 min。七、探针浓度及插入率计算Cy3-CTP 浓度（pmol/ul）=A552/0.15Cy3-CTP 插入率（pmol/ug）= Cy3-CTP 浓度/cRNA浓度（ug/ul）Cy5-CTP 浓度（pmol/ul）=A650/0.25Cy5-CTP 插入率（pmol/ug）= Cy5-CTP 浓度/cRNA浓度（ug/ul）八、芯片杂交1、 cRNA的片段化：Cy3 cRNA X ul（1ug）Cy5 cRNA X ul（1ug）10 control target 50ulRnase-free Water Xul总体积 240ul2、 加入Fragmentation Buffer 10ul ，轻轻混匀后60保温30分钟（不超过30分钟）。3、 加入250ul Hybridization Buffer 轻轻混匀离心。4、 将杂交溶滴加在盖玻片上，盖上芯片并密封芯片于杂交盒中，60滚动杂交16小时。九、芯片洗涤（室温洗涤）1、 洗液配置：洗液1（1升）： DEPC-H2O 700ml 20SSPE 300ml 20%N-Lauroylsarcosine 0.25ml洗液2（1升）： DEPC-H2O 900ml 20SSPE 3.0ml20%N-Lauroylsarcosine 0.25ml洗液3：Stabilization and Drying Solution2、 取出芯片于洗液1中洗涤1分钟3、 再将芯片放入洗液2中洗涤1分钟4、 最后将芯片放入洗液3中洗涤30秒。十、数据分析（另附表格）1、本实验主要是通过使用Agilent Scanner 来获取图像。扫描像素值： 10mm，PMT(%)数值：100图像通常是16-bit tiff文件。2、数据读取与标准化处理图像直接使用Agilent系统相应的图像分析软件Feature Extraction进行定量分析处理。通过对荧光、背景和标准化方式（Linear&Lowess）等参数的设定，图像定量和数据标准化处理一步完成，最后以列表等形式输出。输出的数据通常包括荧光信号，背景信号、标准化后荧光信号与LogRatio值（两种荧光cy3与cy5比值的对数值）等参数。3、Ratio分析一般认为ratio值在0.5-2.0范围内的基因不存在显著的表达差异，而在该范围之外的基因则被认为表达出现显著改变。此域值范围可根据具体实验条件有所调整。4、聚类分析一种数据统计分析的方法。通过建立各种不同的数学模型，可以得到各种统计分析结果，确定不同基因在表达上的相关性，从而找到