适于玉米杂交种纯度鉴定的SSR核心引物的确定及纯度鉴定图谱绘制.pdf

农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology2007 15 6 964 969 基金项目 北京农业育种基础研究创新平台 北京市自然科学基金项目 No YZPT02 06 北京市科技新星项目 No 2003B23 和吉林省科技 计划项目 No 20030555 资助 通讯作者 Author for correspondence 赵久然 研究员 主要从事玉米遗传育种及品种鉴定研究 E mail 戴景瑞 院士 教授 主要从事玉米遗传育种研究 E mail 收稿日期 2006 11 21 接受日期 2007 01 31 研究论文 适于玉米杂交种纯度鉴定的 SSR 核心引物的确定 王凤格 1 2 赵久然 1 王 璐 1 易红梅 1 郭景伦 1 戴景瑞 2 原亚萍 3 卢柏山 1 杨国航 1 1 北京市农林科学院玉米研究中心 北京 100097 2 中国农业大学农学与生物技术学院 北京 100094 3 吉林大学植物科学学院 长春 130062 摘要 为了确定一套适于玉米杂交种纯度鉴定的核心 SSR 引物 利用 10 个 SSR 引物对 420 份已知玉米 杂交 种进行 DNA指纹分析 综合考虑多态性和杂合率两个指标 确定 bnlg161和bnlg1450为玉米杂交种纯度鉴定的首选核心引 物 利用这两个引物进行筛选 412 个品种 占 98 能够找到具有杂合带型的鉴定引物 确定 5 个引物 bnlg439 bnlg125 umc2105 umc1705和 bnlg1792为玉米杂交种纯度鉴定的备选核心引物 研究了纯度鉴定所用特异引物的选择 将特异引物分 为两类 第一类是利用单个引物检测 某品种的基因型仅出现 1次 将该引物作为该品种在特定品种范围内的特异引物 在 420 个品种中 累计29个品种具有第一类特异引物 其中 umc1705和 bnlg1450 作为特异引物的次数最多 均为 8个 phi072和 phi065没有作为特异引物 第二类是根据引物基因频率表 将预测基因型频率低于 2 40 E 03 即1 420 的基因型作为特异基因 型 除了 phi072和bnlg161外 其它 8个引物均可能成为具有特定基因型品种的第二类特异引物 利用推荐的 7个纯度鉴定用 核心引物可进一步筛选每个玉米杂交种的双亲互补型引物 建立了已知玉米杂交种的纯度鉴定 DNA指纹图谱 关键词 玉米 杂交种 SSR 纯度鉴定 核心引物 中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 1006 1304 2007 06 0964 06 Determination of SSR Core Primers for Maize Hybrid Purity Identification WANG Feng ge 1 2 ZHAO Jiu ran 1 WANG Lu 1 YI Hong mei 1 GUO Jing lun 1 DAI Jing rui 2 YUAN Ya ping 3 LU Bai shan 1 YANG Guo hang 1 In order to determine a set of SSR core primers fitting for maize hybrids purity identification 420 maize hybrids were analyzed by 10 SSR primers bnlg439 bnlg125 umc2105 phi072 umc1705 bnlg161 bnlg1792 bnlg162 phi065 and bnlg1450 respectively and two primers bnlg161 and bnlg1450 were determined according to their polymorpism and heterogosite rate as preferred core primers for maize hybrid purity identification Four hundred and twelve hybrids accounting for 98 have heterozygosis band type in at least one primer if the two preferred core primers bnlg161 and bnlg1450 were used five primers bnlg439 bnlg125 umc2105 umc1705 and bnlg1792 were determined as candidate core primers for maize hybrid purity identification Specific primers for purity identification were also studied there were two sorts of specific primer 1 within specific range of varieties the genotype of a primer appeared only in one variety then the primer was used as specific primer of the variety Twenty nine varieties had specific primers within the 420 varieties both umc1705 and bnlg1450 were used as specific primers of 8 varieties while phi072 and phi065 were not used as specific primers of any variety 2 the genotype of a primer had a genotype frequency lower than a specific value then the primer could be used as specific primer of the varieties with such genotype if genotype frequency lower than 2 40 E 03 1 420 were treated as specific genotype eight primers except phi072 and bnlg161 might become the 第 6期 王凤格等 适于玉米杂交种纯度鉴定的 SSR核心引物的确定 玉米品种纯度鉴定对玉米种子质量管理具有重 要意义 随着玉米品种鉴定技术的发展 分子标记技 术已经开始在玉米品种纯度鉴定中得到应用 其中 RAPD标记和 SSR 标记是应用较多的标记技术 然 而 在以往的研究中 为解决少数杂交种的纯度鉴 定 往往需要进行大量的引物筛选工作 才能找到适 合的鉴定引物 赵久然等 1999 从 500 个 RAPD 引 物中筛选出农大 108 等 6 个杂交种中表现双亲互补 型引物的进行纯度鉴定 李晓辉等 2003 从 220 对 SSR 引物中筛选出 58 对引物进行 13 个玉米杂交种 的纯度鉴定 高文伟等 2004 利用 50 对引物筛选两 个玉米杂交种农大 108和豫玉 27 的纯度鉴定引物 吴永升等 2006 利用 10 个 SSR 引物筛选一个玉米 杂交种桂单 22 号的纯度鉴定引物 这些研究在利用 分子标记进行玉米杂交种纯度鉴定方面进行了一些 有益的探索 然而 前期筛选工作量大 且仅限于少 数杂交种的纯度鉴定 能否确定一套适于纯度鉴定 的 SSR 核心引物 并制作已知品种纯度鉴定标准 DNA指纹图谱 这样 对已知品种的纯度鉴定 就不 再需要进行烦琐的引物筛选 即使对未知品种 也只 需进行少量的筛选 就能迅速找到合适的鉴定引物 从而为解决玉米品种纯度鉴定搭建技术平台 加快 SSR 技术在玉米纯度鉴定上的推广应用 本研究旨在通过对 420 个国内玉米杂交种的 DNA指纹分析 确定适于纯度鉴定的核心引物的评 估指标 进而确定一套玉米杂交种纯度鉴定核心引 物 确定特定品种的纯度鉴定的特异引物 进而制作 玉米杂交种纯度鉴定标准 DNA指纹图谱 1 材料和方法 1 1 材料 供试材料均为玉米 单交种 共 420 份 品种名单略 包括向各育种单位直接征集的 240 份生产上已推广的玉米杂交种和本单位承担检 测的 180份参加国家区试的玉米杂交种 其中 6 个 品种 京科 25 京玉 7 号 京品 202 京科 385 浚 99 25 和浚单 20 包括不同来源的两份样品 这些品 种基本上能够代表目前国内玉米新品种的情况 1 2SSR 引物 参考本课题组前期引物筛选研究结果 王凤格 等 2003 王凤格等 2006 从玉米每条染色体上各 选取 1 个 包括 bnlg439 bnlg125 umc2105 phi072 umc1705 bnlg161 bnlg1792 bnlg162 phi065 和 bnlg1450 共 10 个 SSR 引物进行进一步的引物评估 与筛选 以确定出适于纯度鉴定的引物名单 1 3 方法 1 3 1 DNA 提取 采用郭景伦等 1997 的玉米单 粒种子 DNA快速提取法并加以改进 1 3 2 SSR 扩增 反应体系 20 滋 L 反应液中包括 10mmol LTris HCl 50mmol LKCl 0 001 Gelatin 2 5 mmol L MgCl 2 0 16 mmol L dNTP 0 25 滋 mol L SSR 引物 1 U DNA 聚合酶 2 滋 L DNA 模板 SSR 引物由上海生工合成 引物序列信息来自 Maize database 反应程序 94 预变性 5 min 1 个循环 94 变性 40 s 60 退火 35 s 72 延伸 45 s 共 35 个 循环 PCR 扩增在 PTC 100 PCR 仪 MJ Research Watertown MA 上进行 1 3 3 电泳检测 PCR 产物变性后在 4 5 测序胶 上分离 预电泳 85 W 20 min 电泳 80 W 40 min 银 染 10 冰醋酸固定 3 min 双蒸水快速漂洗 1 次 不 超过 10 s 0 2 AgNO 3 溶液染色 5 min 显影液 3 NaOH 0 5 甲醛 显影 10 冰醋酸定影 1 3 4 数据统计分析 根据 SSR 扩增产物在电泳 凝胶上的相对位置 确定不同的等位基因 并按扩增 片段从大到小的顺序 用二位代码记录电泳谱带数 据 依次为 01 02 由于玉米是二倍体及 SSR 标记的共显性特征 因此每个供试品种在每个引物 位点上的基因型用 4 位代码描述 例如 品种 1在引 物 bnlg161 上具有 2条谱带 01 和 07 则该品种的基 因型代码为 0107 品种 2 在引物 bnlg161 上具有 1 条谱带 01 则该品种的基因型代码为 0101 评估引物多态性高低的指标用多态性信息量 polymorphism information content 1 移P i 2 移移2 i 2 j 2 式中 和 分别代表第 个和第 个等位基 因的频率 且 屹 评估引物位点杂合程度的指标用杂合率 杂合率 该引物位点上具有杂合带型的品种数 总品种数 second sort of specific primers of varieties with such genotype Primers with complementary band types were further screened with the seven recommended core primes and DNA fingerprint maps for maize purity identification were constructed hybrid SSR purity identification core primers 965 农 业 生 物 技 术 学 报 2007 年 表 2 供试玉米杂交种的杂合位点数 Table 2 Number of heterozygous loci in the tested maize hybrids 1 具有特定杂合位点数的品种个数与品种总数的比率 1 Rate of number of varieties with special heterozygous loci to number of total varieties 杂合位点数 Number of heterozygous locus 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 品种个数 Number of hybrid 13 41 104 106 90 44 19 3 0 0 0 比率 1 Rate 0 031 0 098 0 248 0 252 0 214 0 105 0 045 0 007 0 000 0 000 0 000 2 结果和分析 2 1 适于纯度鉴定用引物的选择 利用 10 个 SSR 引物建立了 420 个玉米杂交种 的数据库 根据数据库数据统计获得引物的基因频 率及基因型分布的基本信息及多态性和杂合表现等 信息 从表 1 看 不同引物的 值和杂合率的变化 较大 值从最高的 0 838 bnlg1450 到最低的 0 482 phi072 杂合率从最高的 0 888 bnlg161 到 最低的 0 431 bnlg162 此外 值和杂合率这两 个参数并不完全具有协同性 例如 bnlg162 杂合率 最低 但 值比 phi072 和 phi065 高 根据表 1 结果 综合考虑多态性及杂合率 将 10 个引物分为 3 类 1 多态性高 且杂合率高 bnlg161 和 bnlg1450 2 多态性高或中 且杂合率高 或中 umc1705 umc2105 bnlg439 umc1792 和 bnlg12 5 3 多态性低或中 或杂合率低 phi072 phi065 和 bnlg162 其中 第 1 类引物最适于纯度鉴 定 其次是第 2 类 对于第 3 类引物 一般不推荐作 为纯度鉴定优先选用的引物 2 2 具有杂合带型的引物的确定 表 1 SSR 引物的基本评估信息 Table 1 Elementary parameters of 10 SSR primers 利用 10 个引物进行鉴定的结果表明 表 2 所 有 420 个品种均能找到具有杂合带型的引物 且引 物个数最少的为 3 个 398 个 94 8 品种能够找 到至少 5 个具有杂合带型的引物 13 个 3 1 品 种在所有 10 个引物位点均是杂合的 为了检验这套引物的有效性 采用 bnlg161 和 bnlg1450 两个引物 402 个品种 占 98 具有杂合 带型 仅 8 个品种 晋单 32 郑单 14 吉单 32 沈农 T11 硕秋 8 号 郑试 254 农华 139 和怀研 10 不具 有杂合带型 再增加 bnlg439 对这 8 个品种进行检 测 则仅有沈农 T11 不具有杂合带型 而沈农 T11 在 bnlg125 umc2105 umc1705 phi072 和 phi065 这 5个引物上均为杂合带型 2 3 纯度鉴定特异引物的确定 对于特异引物 可以分为两类 第 1 类是在特定 品种范围内 利用单个引物检测 某品种的基因型仅 出现 1 次 称为特异带型 可将该引物作为该品种 在特定品种范围内的特异引物 第 2 类是根据引物 引物 Primer bnlg439 bnlg125 umc2105 phi072 bnlg1705 bnlg161 bnlg1792 bnlg162 phi065 bnlg1450 等位基因数 Number of allele 7 7 9 4 11 8 10 7 4 10 理论基因型数 Expected number of genotype 28 28 45 10 66 36 55 28 10 55 实际基因型数 Real number of genotype 21 23 39 10 39 35 35 22 9 49 值 Value of 0 7064 0 7442 0 8219 0 4823 0 7605 0 8322 0 8263 0 6718 0 5477 0 8382 杂合率 Heterozygous rate 0 6833 0 8238 0 6762 0 5095 0 6952 0 8881 0 8000 0 4309 0 6429 0 7714 最大基因频率 Max allele frequency 0 2952 0 2893 0 2476 0 6631 0 3202 0 2202 0 231 0 4048 0 4964 0 2321 最小基因频率 Mini allele frequency 3 57E 03 1 07E 02 3 57E 02 8 93E 02 4 76E 03 4 29E 02 1 19E 03 7 14E 03 1 07E 02 1 07E 02 966 第 6期 王凤格等 适于玉米杂交种纯度鉴定的 SSR核心引物的确定 特异引物 Specific primer bnlg439 bnlg125 umc2105 umc1705 bnlg161 bnlg1792 bnlg162 bnlg1450 个数 Number 1 2 4 8 1 3 2 8 品种 Variety DH3501 登海9号Denghai 9 吉单342 Jidan 342 陕单911 Shandan 911 京科8 Jingke 8 涿单13 Zhuodan 13 天泰14 Tiantai 14 吉单342 Jidan 342 农华046 Nonghua 046 强盛1号Qiangsheng 1 DH3605 承玉6号Chengyu 6 DH3791 高光158 Gaoguang 158 农华022 Nonghua 022 M118 浚 9810 Xun 9810 京科349 Jingke 349 冀承单3号Jichengdan 3 CF287 吉单158 Jidan 158 京科4号Jingke 4 M3309 吉单415 Jidan 415 亚杂1号Yaza 1 浚 99 25 Xun 99 25 DH2101 农华103 Nonghua 103 安玉9号Anyu 9 基因型 Genotype 0107 0406 0507 0102 0107 0304 0409 0102 0104 0111 0311 0506 0509 0511 0609 0102 0107 0308 0709 0102 0107 0102 0103 0110 0203 0207 0305 0610 0810 实际基因型频率 Realized genotype frequency 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 2 40 E 03 理论基因型频率 Expected genotype frequency 1 05E 03 4 20E 03 2 40E 03 8 10E 03 9 20E 03 3 50E 03 4 10E 03 1 70E 03 2 30E 03 1 30E 03 1 50E 03 6 40E 04 8 00E 04 2 40E 03 3 00E 03 6 20E 03 7 80E 03 1 80E 04 1 10E 03 1 40E 03 2 00E 03 5 50E 03 1 00E 03 6 60E 04 1 50E 03 6 40E 03 2 60E 03 2 50E 03 1 50E 03 基因频率表 预测基因型频率低于一定值的基因型 可将该引物作为具有该基因型的品种的特异引物 如果作为纯度鉴定的特异引物 还需限定其基因型 应为杂合基因型 对于第 1 类特异引物 表 3 汇总了所有 420 个 玉米杂交种利用 10 个引物检测的结果 累计 29 个 品种具有特异引物 其中 umc1705 和 bnlg1450 作为 特异引物的次数最多 分别为 8 个 而 phi072 和 phi065 没有作为特异引物 出现特异带型的个数与 引物的多态性没有直接相关 如 bnlg161 多态性仅 低于 bnlg1450 但是仅在 1个品种上具有特异带型 而 umc1705 多态性排在第 5 位 而作为特异引物的 次数达 8次 计算出的这些特征带型的实际基因型 频率均应为 2 40 E 03 1 420 而理论基因型频率最 高的为 9 20E 03 最低的为 1 80E 04 12 个品种的 理论基因型频率高于实际基因型频率 对于第二类特异引物 表 4列出了每个引物理 论上所具有的最低基因型频率及对应的基因型 单 个引物基因型频率最低的为 bnlg1792 的 0307 带 型 达到 5 7E 06 如果将预测基因型频率低于 2 40 E 03 即 1 420 的基因型作为特异基因型 则 phi072 和 bnlg161 对任何品种均不可能成为特异引物 而 其它 8 个引物则有可能成为具有特定基因型的品种 的特异引物 值得注意的是 从多态性和杂合率上 看 bnlg161 属于多态性和杂合率较高的引物 而 phi072 属于多态性和杂合率较低的引物 这表明 能否找到特异引物 与引物的多态性和杂合率没有 直接的线性关系 而与引物不同等位基因出现频率 的均匀程度关系较大 表 3 具有特异引物的玉米品种及其基因型 Table 3 The maize hybrids with specific primes and their genotypes 967 农 业 生 物 技 术 学 报 2007 年 表 4 引物具有最低基因型频率的基因型 Table 4 Genotype with minimal genotype frequency in the primers 3 讨论 3 1 玉米杂交种纯度鉴定用核心引物的选择标准 玉米杂交种纯度鉴定的两个目的 一是验自交 苗 这是最主要的目的 仅需要 1 对双亲互补型引物 就可以 二是验异型株 需要用特异引物或引物组 合 使得出现相同带型品种的概率足够低 从而能有 效地区分出异型株 基于这两点 适于纯度鉴定的核心引物必须具 备以下两个特征 1 杂合率高 从而具有较强的区 分自交苗的能力 能够比较容易筛选到双亲互补型 的引物 2 多态性高 从而具有较高的区分异型株 的能力 只有这样 才能保证预筛时仅采用少数引物 就可以比较容易找到符合要求的引物 在本研究评估的 10个引物中 综合表现最好的 2个引物是 bnlg161和 bnlg1450 采用这 2 个引物进 行筛选 98 的品种均可以找到具有杂合带型的引 物 满足检验自交苗的需要 且这两个引物多态性 高 具有较高的验杂的能力 因此 这两个引物可以 推荐作为纯度鉴定的首选核心引物 并考虑在今后 的研究中 将这两个引物进一步重新设计组成稳定 的两重 PCR 组合 以便今后在纯度鉴定中大量使 用 其它 5 个引物 bnlg439 umc1705 umc2105 bnlg125 和 bnlg1792 尽管综合表现比上述两个引物 略差 但基本上满足要求 因此 推荐作为纯度鉴定 的备选引物 补充解决上述两个引物不能鉴定的品 种 其它 3 个引物 phi072 phi065 和 bnlg162 多态 性或杂合率偏低 一般不建议作为纯度鉴定的引物 因此 如果不考虑引物的多态性 即引物区分异型株 的能力 仅考虑引物区分自交苗的能力 这 10 个引 物完全可以满足纯度鉴定的需要 而且 优先选用其 中 2 3 个引物 例如 bnlg161 和 bnlg1450 就可解决 绝大部分品种的纯度鉴定 比较玉米杂交种纯度鉴定与真实性鉴定在核心 引物选择上的异同 尽管二者基本要求相同 但侧重 点有所不同 从核心引物选择标准上看 纯度鉴定侧 重于引物杂合率的指标 其次是多态性指标 真实性 鉴定 包括 DNA 指纹数据库构建 侧重于引物多态 性的指标 并要求所用的多个引物间没有连锁或连 锁低 对杂合率指标没有特殊要求 从所用引物数量 上看 纯度鉴定每份样品一般检测 100 个单株 增加 检测的引物数量会造成工作量的成倍增加 因此 侧 重于选择适于特定品种纯度鉴定的特异引物 一般 只需要单个引物即可 而真实性鉴定每份样品一般 检测 5 10 个单株 如果品种一致性较高 还可减少 检测数量 对每份样品而言 增加检测的引物数量不 会造成工作量的较大增加 而且 由于玉米品种数量 很大 要找到所有品种的特异引物是不可能的 因 此 只能用多个引物的组合进行检测 王凤格等 2003 郭景伦等 2000 3 2 特定品种纯度鉴定所用特异引物选择标准 确定纯度鉴定的特异引物 其意义在于 对于特 定品种 不需要多个引物的组合 而仅需一个引物就 可以同时检验自交株和异型株 从而可以大大减少 纯度鉴定的成本 Yashitola 2002 核心引物是 用于筛选品种纯度鉴定用特异引物的首选引物 但 对每个特定品种的纯度鉴定 根据检测实践 所选用 的引物还应该满足以下几个特征 1 具有双亲互补带型 有研究表明 赵久然 等 1999 李晓辉等 2003 适于杂交种纯度鉴定的 谱带类型应为 双亲互补型 其它类型包括 偏父 型 偏母型 杂种型 等均不适于纯度鉴定 随机 抽取具有杂合带型的部分品种 加上其父母本 验证 是否为典型的双亲互补型 本研究结果表明 双亲 互补型 是最主要的谱带类型 对少数出现偏父型 偏母型或杂种型的情况 通过进一步的实验 发现主 要是由于实验中所用的父母本自交系并非杂交种的 原配亲本 而来源于不同育种单位 不同地点或不同 世代的同名自交系有可能在若干位点上产生变异 进而造成所谓的偏父型 偏母型和杂种型 2 基因型频率足够低 在特定品种范围内 该 基因型具有相对唯一性 或者理论基因型频率低于 设定值 因此 计算品种在拟用引物位点的基因型频 率 如果低于设定的值 则可将该引物作为该品种纯 度鉴定特异引物 如果找不到基因型频率低于设定 引物 Primer bnlg439 bnlg125 umc2105 phi072 umc1705 bnlg161 bnlg1792 bnlg162 phi065 bnlg1450 最低基因型 Minimal genotype 0106 0405 0405 0203 0110 0710 0208 0307 0106 0203 0310 最低基因型频率 Minimal genotype frequency 1 1E 04 2 6E 04 1 5E 03 8 0E 03 3 4E 05 2 8E 03 5 7E 06 2 1E 04 1 8E 03 1 8E 04 968 第 6期 王凤格等 适于玉米杂交种纯度鉴定的 SSR核心引物的确定 参 考 文 献 Gao W W 高文伟 Li X H 李晓辉 Tian Q Z 田清震 Li M S 李明顺 Li X H 李新海 and Zhang S H 张世煌 Seed pu rity testing of maize hybrid Nongda108 and Yu27 by SSR marker analysis J 种子 2004 23 5 32 33 in Chi nese Guo J L 郭景伦 Zhao J R 赵久然 Kong Y F 孔艳芳 Yu D M 尉德铭 Lu B S 卢柏山 and Wang Y D 王元东 Studies on the utilization of primer combination in maize inbred lines identification using DNA fingerprints J 华北农学报 2000 15 2 27 31 in Chinese with English abstract Guo J L 郭景伦 Zhao J R 赵久然 Yu D M 尉德铭 and Guo Q 郭 强 New method of extracting DNA from maize single seed J 北京农业科学 1997 15 2 1 2 in Chinese with English abstract Li X H 李晓辉 Li X H 李新海 Li W H 李文华 Wang Z H 王振华 Ma F M 马凤鸣 Yuan L X 袁力行 and Zhang S H 张世煌 Application of SSR markers in hybrid seed purity test of maize J 作物学报 2003 29 1 63 68 in Chinese with English abstract Wang F G 王凤格 Zhao J R 赵久然 Guo J L 郭景伦 She H D 佘花娣 and Chen G 陈刚 Comparison of three DNA fingerprint analyzing methods for maize cultivars identifica tion J 分子植物育种 2003 1 5 6 655 661 in Chinese with English abstract Wang F G 王凤格 Zhao J R 赵久然 Dai J R 戴景瑞 Yi H M 易红梅 Kuang M 匡猛 Sun Y M 孙艳美 Yu X Y 于 新艳 Guo J L 郭景伦 and Wang L 王璐 Selectio