病原学的确立.pdf

Corresponding author email ypeng78 1 S A R S 病原学的确立 北大医学部微生物学系 彭宜红 朱永红 自 2 0 0 2 年 1 1 月 1 6 日我国广东省佛山市发现第一例原因不明的严重呼吸道传染病以 来 1 2 截至 2 0 0 3 年 2 月 1 1 日 根据国家卫生部向世界卫生组织 W o r l d H e a l t h O r g a n i z a t i o n W H O 通报的疫情显示 广东省有 3 0 5 例感染病例 至少 5 人死亡 3 由 于病人主要表现为高烧 干咳 全身酸痛 呼吸困难等症状 且病因不明 当时广州的专 家根据临床症状判断可能是由病毒感染引起 据此称之为非典型肺炎 a t y p i c a l p n e u m o n i a 1 4 因其传 染 性 强 传播快 病死率较高 4 月 8 日 国务院将其列为我国 法定的传染病 称为传染性非典型肺炎 5 2 0 0 3 年 2 月下旬香港和越南等地也出现了类 似病例 3 6 当时在越南参加救治工作的 W H O 专家 C a r l o U r b a n i 博士首次将这类疾病命名 为 严重急性呼吸系统综合征 S e v e r e A c u t e R e s p i r a t o r y S y n d r o m e S A R S 7 3 月 2 9 日 U r b a n i 医生因患 S A R S 以身殉职 为了对 这位医生的永恒怀念 4 月 1 6 日 W H O 正式将 这种原因不明的新疾病命名为 S A R S 7 8 即严 重急性呼吸系统综合征 由于引起 S A R S的病因不明 为了尽快找到病原以控制其在全球快速蔓延 3 月 1 7 日 以 W H O 全球流感监测网为基础 其首席科学家 K l a u s S t h r 博士邀请欧亚美三大洲的 9 个 国家和地区的 1 1 个实验室 组建了一个 全球虚拟实验室 S t o h r s n e t w o r k l a b s 9 整合和共享世界各国的研究资源 在 S A R S 的病原学研究方面联合攻关 3 月 2 8 日 中 国国家疾病预防控制中心和中国广东省疾病预防控制中心也正式加入这一研究网络 1 0 通 过电话会议 网络和电子邮件等形式 网络虚拟实验室的各国科学家们彼此交换研究进展 图片 标本材料和试剂等 这种联合攻关 资料共享的机制和科学家们夜以继日地工作大 大加速了病原学研究进展 在寻找S A R S 的病原学过程中 衣原体 甲型禽流感病毒 H 5 N 1 副粘病毒和h M P V h u m a n m e t a p n e u m o v i r u s 等曾先后被列入可能病原的名单 1 1 1 3 截止到3 月底 各研究室的研究 结果基本排除S A R S 病原体为甲 乙型流感病毒 呼吸道合胞病毒 副流感病毒1 2 3 型 腺病毒 鼻病毒 肠道病毒 h M P V 肺炎支原体 肺炎衣原体等微生物 1 2 1 4 在排除甲型禽流感病毒 H 5 N 1 为 S A R S 的可能病因后 1 3 3 月 1 7 日香港大学微生物学 系的研究工作取得了突破性进展 1 3 1 5 发现接种了病人标本的多种细胞混合培养物中出现 明显的细胞病变现象 用 S A R S 病人急性期和恢复期双份血清处理培养的细胞 证实恢复期 血清可明显抑制培养细胞中的细胞病变效应 而急性期血清则无任何作用 这表明培养物 中有某种可能引起 S A R S的病原体存在 3 月 2 2 日他们用电镜在细胞培养物中发现冠状病 毒样颗粒 据此线索 3 月 2 3 日用 R T P C R 技术在 8 份可疑病人的标本中检测到有 2 份冠状 病毒 R N A 阳性 1 3 1 5 香港大学微生物学系于 3 月 2 7 日正式对外发布了冠状病毒可能是引起 S A R S 病因的研究结果 几乎同时 3 月1 8 日美国疾病预防控制中心 C e n t e r s f o r D i s e a s e C o n t r o l a n d P r e v e n t i o n C D C 的研究人员从接种病人标本的细胞培养物中也观察到细胞病变现象 3 月2 2 日用电镜观察到细胞培养物中典型的冠状病毒样颗粒 随即用已知的3 5 4 0 种不同的 Carlo Urbani 博士 7 2 冠状病毒抗体检测 表明培养物中的冠状病毒样颗粒 与抗猪和人的冠状病毒抗体呈阳性反应 3 月2 3 日加州 大学旧金山分校的科学家用基因芯片技术验证该病原 体为一个从未认知的新型的冠状病毒 1 4 1 6 3 月2 4 日 美国抢先对外报道了一种新型冠状病毒可能是S A R S 病 因的消息 1 6 3 月2 4 2 6 日 德国的实验室通过P C R 方 法检测到冠状病毒 并发现获得的病毒序列与已知冠 状病毒的多聚酶基因相符 但同源性有明显的 差异 1 2 1 3 1 7 进一步证 实香港大学和美国C D C 的 结论 此后 加拿大 法国 日本 新加坡分别用V e r o 细胞分离培养 电镜观察 P C R 方法等发现了冠状病毒 1 2 在疾病发生的过程中 我国学者对 S A R S 的病原学也进行了广泛的研究 早在 2 月 1 1 日 广东省广东市非典型肺炎的新闻发布会上有关人员称 用分子生物学实验研究已经排 除了原因不明的非典型肺炎是炭疽 鼠疫以及禽流感和流行性出血热的可能 4 1 1 2 月 1 8 日中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所的专家报道 1 1 1 9 在 5 例非典型肺炎病例的尸 解标本中用电镜发现典型的衣原体样颗粒 由此推断衣原体可能为此疾病的病因 但这与 病人的临床症状有较大的差异 而且病原体的确定是一项复杂的工作 要遵循郭霍假说的 标准 1 8 仅有形态学指标是不够的 因此 衣原体 论未得到公认 据报道 2 0 中国军事 医学科学院自 2 月 1 5 日就从广东采集到 S A R S 病人的标本 2 月 2 6 日 研究人员用高倍电 子显微镜观察到分离出的病毒颗粒 经过反复分析和专家验证 初步确定 S A R S 的病原体可 能是一种冠状病毒 之后 通过对病毒核酸序列的测定 并与动物冠状病毒的核酸序列进 行对比 得到进一步验证 3 月 2 1 日 军科院第一个向国家卫生部报捷 发现 S A R S 元凶 为冠状病毒 4 月 1 0 日中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所李德新 毕胜利等宣布 从 S A R S 尸体标本的肺和脾脏中扩增出冠状病毒基因 并成功地分离到冠状病毒 2 1 4 月 1 2 日 广州市呼吸疾病研究所和香港大学联合举行新闻发布会宣布 他们在病人的分泌物 中已经成功分离出冠状病毒 并称该报告一周前已经层层上交 1 9 另外 广东省疾病预防 控制中心称 自 2 0 0 3 年 1 月以来采用多种不同的细胞接种了大量的非典型肺炎病人急性期 咽拭子 咽漱液 肺组织等样本 结果在几种细胞培养中发现细胞有病变 但研究结果未 对外正式公布 1 9 4 月 1 2 日 加拿大 B C 肿瘤研究所基因组科学中 心 B C C a n c e r A g e n c y s G e n o m e S c i e n c e s C e n t r e 首次在网上公布了新型冠状病毒的全基因组序列 2 2 截止到 5 月 9 日 全世界共完成 1 1 株 S A R S 相 关冠状病毒的全基因组序列测定 其中加拿大 2 2 美国 2 3 中国 2 4 和新加坡 2 5 的 4 个研究组分别发表 了相关的研究论文 从核苷酸和演绎的氨基酸序列 分析表明 1 1 株 S A R S 冠状病毒均有典型的冠状病 毒的基因组结构 2 2 2 6 但在核苷酸和演绎的氨基酸 序列水平 与以往报道的任何一种感染人和动物的 冠状病毒同源性均有较大的差异 不属于任何一种 已知的人和动物的冠状病毒 种系进化分析表明 S A R S 冠状病毒为独立于冠状病毒属中已知的 3 个 群 g r o u p 之外的一个新群 第 4 群 g r o u p 4 2 2 2 5 系统进化树图 2 3 S A R S 冠状病毒 U r b a n i 株 与已知的 冠状病毒1 3 群S 区演绎的氨基酸序列 SARS 冠状病毒电镜图 28 100nm 3 为了进一步确立 S A R S 冠状病毒的致病性 明确 S A R S 的真正病因 在分离到冠状病毒 后 荷兰阿姆斯特丹的 E r a s m u s 大学的研究人员立即进行了动物实验 发现感染病毒的两 只猕猴 m a c a q u e s 出现了发热 咳嗽 呼吸困难等与 S A R S 病人相同的症状 4 月 1 6 日 W H O 于网上发布了动物试验的初步结果 8 随后 更详细的研究在 N a t u r e 上发表 2 7 实验 表明 用细胞培养获得的 S A R S 相关冠状病毒感染猕猴 3 天后动物出现明显的临床症状 可从其鼻咽分泌物中检测到病毒的 R N A 并可用 V e r o 细胞分离出该冠状病毒 电镜下可见 培养物中新型冠状病毒的典型形态 肺部病理切片可见肺泡细胞明显受损 在感染后 1 6 天的猕猴恢复期血清中 用间接免疫荧光技术检测到有特异性抗体存在 S A R S 动物模型的 建立 为明确 S A R S 的病原学提供了重要的依据 S A R S 是一种新出现的严重传染病 确立新的传染病病因 郭霍假说 K o c h s p o s t u l a t e s 是目前公认遵循的原则 随着对传染病的不断认识和发展 郭霍假说也得到 不断补充和完善 对于确立病毒性疾病的病原学而言 必须符合修正的郭霍假说 1 8 在 S A R S 病原学研究中 用经典的病毒培养法 血清学技术和动物模型和现代分子基因技术等取得 的一系列重要的进展 使得新型冠状病毒能全部满足修正的郭霍假说的全部要求 见附录 4 月 1 6 日 W H O 正式宣布 8 一种未知的新型冠状病毒是引起 S A R S 的真正病因 并将该病毒 命名为 S A R S 冠状病毒 S A R S c o r o n a v i r u s S A R S C o V o r S C V 或直接称为 S A R S 病毒 S A R S v i r u s 但病毒的正式命名还需国际病毒分类和命名委员会确认 自世界卫生组织 W H O 倡导组成的 1 0 个国家和地区 1 3 个实验室的 S A R S 联合攻关后 仅仅短短的一个月的时间 科学家们就找到了 S A R S 的病因 S A R S 冠状病毒 如此惊人的 速度在病毒学研究史中是前所未有的 作者认为主要与以下三个因素有关 首先 全球信 息化对加速研究进展起到重要的促进作用 世界卫生组织的 S t o h r s n e t w o r k l a b s 为全 世界相关领域的顶级科学家彼此交换研究进展 启发研究思路和协调联合攻关方面无疑是 开创了一个良好的先河 这是当今全球信息化时代科学研究发展的新趋势 其次 成熟的 应急研究平台和技术力量的合理调配也是这次高效率的研究不可缺少的重要条件 以香港 大学微生物学系的成功经验为例 自 1 9 9 7 年香港爆发禽流感以来 在新病毒的培养 分离 鉴定 诊断试剂的研制方面建立了一套完善的应急研究平台 锻炼了一批具有国际竞争力 的研究人员 同时也开辟了与国际间相关实验室良好的沟通渠道 建立了一套高速有效的 科研应急机制 在 S A R S 疫情发生的初期 他们就以高度的职业敏感性开始寻找病原体的工 作 他们将现有的研究人员分成 3 组 即病毒分离培养研究小组 形态学研究小组 分子 病毒学技术研究小组 从三个方面追踪病原体 在众多的国际一流研究机构中脱颖而出 首先分离到 S A R S 冠状病毒 首次在网上公布了 S A R S 冠状病毒的电镜形态 首次以论文的 形式描述和确定了香港 5 0 例 SARS 病人的临床表现和发病原因 在病原学研究方面拨得头 筹 1 3 1 5 成功的经验值得同行们的深思和借鉴 另外 S A R S 冠状病毒本身具备的生物学特 性也是决定病原学研究能取得快速进展的一个重要原因 与以往感染人的冠状病毒不同 S A R S 冠状病毒能很好地适应体外细胞分离培养并形成明显的细胞病变 有典型的具有鉴 别意义的形态学特征 体内的病毒含量较高 抗原性强 能引起典型的体液免疫应答 2 9 有易感的动物模型 有其他冠状病毒的研究资料和技术方法供参考 S A R S 冠状病毒是 冠状病毒属的一个新群 并不是人类从未认知的全新的病毒 这些生物学特性为病毒学家 的研究工作提供了难得的有利的条件 因此科学家们在短期内能在确定病原学研究方面个 个突破 使得新型冠状病毒能全部满足确定新病原体的 金标准 郭霍假说的全部要求 S A R S 冠状病毒的这些生物学特性在病毒中是不多见的 例如 同属引起人类冠状病毒的 2 2 9 E 株和 O C 4 3 株 至今尚不易在体外行分离培养 感染后也不引起明显的免疫应答 1 9 9 7 年新发现的 T T 病毒 T T v i r u s 至今既不能在体外人工培养 也不引起明显的免疫应答 3 0 这些特性在一定程度上限制了病毒学的研究工作 4 S A R S 的病原目前已水落石出 重温 S A R S 冠状病毒被确立为病原体的过程 其中有许多 东西值得学习和借鉴 在 S A R S 病原学研究中 中国内地的科学家虽然拥有天时地利之便 但在整个研究过程中多只能跟踪前沿 而不能引导潮流 技术力量和实验条件的落后固然 是其中的原因 但决不是最重要的原因 人类与病毒的较量不会就此而止 希望通过 S A R S 的洗礼和磨练 中国的科学家下一次能做得更好 附 4 月 1 6 日前病原学研究方面的重要的进展 1 多个实验室从不同国家 S A R S 病人标本用 V e r o 细胞和 F R h k 4细胞分离培养到 S A R S 冠状病毒 并能连续传代 1 5 1 7 2 1 2 8 2 在病毒细胞培养物和病人呼吸道等标本中用电镜看到冠状病毒样颗粒 1 5 2 1 2 8 3 病毒在V E R O和 F R h k 4细胞中引起的细胞病变效应 能被病人恢复期血清所抑制 免 疫荧光技术证明病人血清可以和病毒的组织培养物产生免疫荧光反应 1 5 1 7 2 8 4 用分子生物学技术检测发现 9 0 S A R S 病人标本和细胞培养物中检测到 S A R S 冠状病 毒 R N A 1 5 2 1 2 8 扩增产物的部分测序结果表明 该病毒可能为一种新型冠状病毒 1 6 1 7 另外 在 4 0 例非 S A R S 呼吸道疾患中 S A R S 冠状病毒的 R N A 均为阴性 在 2 0 0 份献血者的血清标 本中也未发现抗 S A R S 冠状病毒的抗体 1 5 5 建立了 S A R S 动物模型 感染 S A R S 冠状病毒的猴产生与人相同的症状 从其体内分 离到 S A R S 冠状病毒 并检测到相应的特异性抗体 部分结果在 5 月 1 5 日 N a t u r e 上发表 8 2 7 6 全基因组序列和部分基因序列分析表明 新型冠状病毒为独立于冠状病毒属中已知 的 3 个群 g r o u p 之外的一个新群 第 4 群 1 5 1 7 2 1 2 5 2 8 参考文献 1 W H O C u m u l a t i v e N u m b e r o f R e p o r t e d C a s e s o f S e v e r e A c u t e R e s p i r a t o r y S y n d r o m e S A R S M a r c h 3 1 2 0 0 3 h t t p w w w w h o i n t c s r s a r s a r c h i v e 2 0 0 3 0 3 3 1 e n 2 2 1 世纪经济报道 中国 2 7 省市 S A R S 传播源头追踪 h t t p f i n a n c e s i n a c o m c n r o l l 2 0 0 3 0 5 1 8 1 1 4 1 3 4 1 7 3 1 s h t m l 3 W H O W e e k l y e p i d e m i o l o g i c a l r e c o r d 14 MARCH 2003 78th YEAR 14 MARS 2003 h t t p w w w w h o i n t w e r p d f 2 0 0 3 w e r 7 8 1 1 p d f 4 南方周末 广州抗击不明病毒 2 0 0 3 0 2 1 3 5 中华人民共和国卫生部令 第 35 号 传染性非典型肺炎防治管理办法 卫生部 2003 05 13 6 B e r n e d S e b a s t i a n K a m p s K a m p s H o f f m a n n 1 T i m e l i n e S A R S R e f e r e n c e F i r s t E d i t i o n M a y 8 2 0 0 3 h t t p s a r s r e f e r e n c e c o m i n d e x h t m 7 B R e i l l e y M V H e r p D a n S e r m a n d e t a l S A R S a n d C a r l o U r b a n i N E n g l J M e d 3 4 8 2 0 1 9 5 1 1 9 5 2 D o w n l o a d e d f r o m h t t p w w w n e j m o r g o n M a y 1 5 2 0 0 3 8 W H O C o r o n a v i r u s n e v e r b e f o r e s e e n i n h u m a n s i s t h e c a u s e o f S A R S 1 6 A p r i l 2 0 0 3 h t t p w w w w h o i n t c s r s a r s a r c h i v e 2 0 0 3 0 4 1 6 e n 9 W H O W H O c o l l a b o r a t i v e m u l t i c e n t r e r e s e a r c h p r o j e c t o n S e v e r e A c u t e R e s p i r a t o r y S y n d r o m e S A R S d i a g n o s i s 1 7 M a r c h 2 0 0 3 h t t p w w w w h o i n t c s r s a r s p r o j e c t e n 1 0 W H O C h i a n j o i n s W H O c o l l a b o r a t i v e n e t w o r k M a r c h 2 8 2 0 0 3 5 2 8 h t t p w w w w h o i n t c s r s a r s a r c h i v e 2 0 0 3 0 3 2 8 e n 1 1 洪涛 王健伟 孙异临等 电镜观察从非典型肺炎患者尸检标本中发现衣体样和冠状病毒样颗粒 中华 医学杂志 8 3 6 3 2 6 3 6 2 0 0 3 1 2 B e r n e d S e b a s t i a n K a m p s K a m p s H o f f m a n n 2 V i r o l o g y S A R S R e f e r e n c e F i r s t E d i t i o n M a y 8 2 0 0 3 h t t p s a r s r e f e r e n c e c o m i n d e x h t m 5 1 3 D e n n i s N o r m i l e U p c l o s e a n d P e r s o n a l W i t h S A R S S c i e n c e 3 0 0 9 M a y 2 0 0 3 w w w s c i e n c e m a g o r g 1 4 G l o b a l C o l l a b o r a t i o n o n S A R S B e a r s F r u i t h t t p c m b i b j m u e d u c n n e w s 0 3 0 5 2 0 1 h t m 1 5 P e i r i s J S M L a i S T P o o n L L M e t a l C o r o n a v i r u s a s a p o s s i b l e c a u s e o f s e v e r e a c u t e r e s p i r a t o r y s y n d r o m e L a n c e t e a r l y o n l i n e r e l e a s e 2 0 0 3 A p r 8 A v a i l a b l e h t t p i m a g e t h e l a n c e t c o m e x t r a s 0 3 a r t 3 4 7 7 w e b p d f 1 6 C D C L a b A n a l y s i s S u g g e s t s N e w C o r o n a v i r u s M a y C a u s e S A R S M a r c h 2 4 2 0 0 3 h t t p w w w c d c g o v o d o c m e d i a p r e s s r e l r 0 3 0 3 2 4 h t m 1 7 C D r o s t e n S G n t h e r W P r e i s e r e t a l I d e n t i f i c a t i o n o f a N o v e l C o r o n a v i r u s i n P a t i e n t s w i t h S e v e r e A c u t e R e s p i r a t o r y S y n d r o m e T h e n e w e n g l a n d j o u r n a l o f m e d i c i n e p u b l i s h e d a t w w w n e j m o r g o n A p r i l 1 0 2 0 0 3 1 8 Rivers T M J Koch s postulates modified by for viral diseases Bacteriol 33 1 12 1937 修改的郭霍假说 1 必须在可疑病例中发现并分离出同一种病原微生物 2 病原微生物能在体外纯培养并 连续传代 3 纯培养物可通过细菌滤器 4 通过滤器的纯培养物接种易感动物能引起典型的疾病 5 从感 染的实验动物中重新分离出相同的病原体 6 能从感染的机体中检测出对这种病原体特异性免疫反应 A c c o r d i n g t o K o c h s p o s t u l a t e s a s m o d i f i e d b y R i v e r s f o r v i r a l d i s e a s e s s i x c r i t e r i a a r e r e q u i r e d t o e s t a b l i s h a v i r u s a s t h e c a u s e o f a d i s e a s e 1 1 i s o l a t i o n o f v i r u s f r o m d i s e a s e d h o s t s 2 c u l t i v a t i o n i n h o s t c e l l s 3 a n d p r o o f o f f i l t e r a b i l i t y 4 p r o d u c t i o n o f c o m p a r a b l e d i s e a s e i n t h e o r i g i n a l h o s t s p e c i e s o r a r e l a t e d o n e 5 r e i s o l a t i o n o f t h e v i r u s 6 d e t e c t i o n o f a s p e c i f i c i m m u n e r e s p o n s e t o t h e v i r u s 1 9 财经时报 军科院 突破封锁 采集标本查找 S A R S 元凶始末 h t t p n e w s s i n a c o m c n c 2 0 0 3 0 5 3 1 1 4 1 4 1 1 2 0 3 9 1 s h t m l 2 0 诚实的胜利 非典病原体确认为冠状病毒始末 h t t p w w w s i n a c o m c n 2 0 0 3 年 0 5 月 1 6 日 南风窗 2 1 我国在非典型肺炎的病原学研究上取得重大突破 中国新闻网 2 0 0 3 年 0 4 月 1 0 日 2 2 M a r r a M A J o n e s S J M A s t e l l C R e t a l T h e G e n o m e S e q u e n c e o f t h e S A R S A s s o c i a t e d C o r o n a v i r u s S c i e n c e 2 0 0 3 P u b l i s h e d o n l i n e 1 M a y 2 0 0 3 h t t p w w w s c i e n c e m a g o r g c g i c o n t e n t a b s t r a c t 1 0 8 5 9 5 3 v 1 2 3 R o t a P A O b e r s t e M S M o n r o e S S e t a l C h a r a c t e r i z a t i o n o f a N o v e l C o r o n a v i r u s A s s o c i a t e d w i t h S e v e r e A c u t e R e s p i r a t o r y S y n d r o m e S c i e n c e 2 0 0 3 P u b l i s h e d o n l i n e 1 M a y 2 0 0 3 2 4 Q I N E d e Z H U Q i n g y u Y U M a n a t a l A c o m p l e t e s e q u e n c e a n d c o m p a r a t i v e a n a l y s i s o f a S A R S a s s o c i a t e d v i r u s I s o l a t e B J 0 1 C h i n e s e S c i e n c e B u l l e t i n 4 8 9 4 1 9 4 8 2 0 0 3 2 5 Y i J u n R u a n C h i a L i n W e i L i n g A i E e e t a l C o m p a r a t i v e f u l l l e n g t h g e n o m e s e q u e n c e a n a l y s i s o f 1 4 S A R S c o r o n a v i r u s i s o l a t e s a n d c o m m o n m u t a t i o n s a s s o c i a t e d w i t h p u t a t i v e o r i g i n s o f i n f e c t i o n T H E L A N C E T P u b l i s h e d o n l i n e M a y 9 2 0 0 3 h t t p i m a g e t h e l a n c e t c o m e x t r a s 0 3 a r t 4 4 5 4 w e b p d f 2 6 M i c h e l l e H s i a n g s C o r o n a v i r i d a e W e b p a g e h t t p w w w s t a