通过四倍体补偿实验证明iPS细胞具有发育全能性.pdf

1994 2010 China Academic Journal Electronic Publishing House All rights reserved 中国基础科学 研究进展 2010 3 China Basic Science 18 通过四倍体补偿实验证明iPS细胞具有发育全能性 周 琪 1 曾凡一 2 1 计划生育生殖生物学国家重点实验室 中国科学院动物研究所 北京100101 2 上海交通大学医学院 上海200025 收稿日期 20102124 修回日期 201025219 本文作者 周 琪 研究员 qzhou ioz ac cn 曾凡一 教授 上海交通 大学医学院上海医学遗传研究所 研 究 资 助 国 家973计 划 2006CB701500 2007CB947800 2007CB947700 国家自然科学基金 30525040 30871379 C0607 该研究入选2009年度中国基础研究十大新闻 摘 要 本研究首次利用诱导性多能干细胞 iPS 细胞 通过四倍体囊胚注射得到存活并 具有繁殖能力的小鼠 研究中 我们制备了 37株iPS细胞系 其中3株iPS细胞系获得了 共计27个活体小鼠 经多种分子生物学技术 鉴定 证实该小鼠确实从iPS细胞发育而成 其中一些小鼠现已发育成熟并且繁殖了后 代 这是世界上第一次获得完全由iPS细胞制 备的活体小鼠 有力地证明了iPS细胞具有真 正的全能性 这项工作为进一步研究iPS技 术在干细胞 发育生物学和再生医学领域的 应用提供了技术平台 将iPS细胞研究推到了 新的高度 也为中国在这一国际热点研究领 域取得领先地位做出了重要的贡献 关键词 诱导性多能干细胞 四倍体补偿实验 中图分类号 Q813 文献标识码 A 文章编号 100922412 2010 0320018203 DO I 10 3969 j issn 100922412 2010 03 004 iPS细胞全称为诱导性多能干细胞 induced plu2 ripotent stem cell 是由分化的体细胞诱导而成 具 有和胚胎干细胞类似的发育多潜能性的干细胞 2006年Yamanaka博士等通过外源表达Oct4 Sox2 Klf4和c2M yc成功诱导体细胞重编程为具有多能性 的iPS细胞 1 2007年 11月 美国和日本科学家获 得了人类的iPS细胞 2 3 被 科学 Science 杂志评 为2008年世界十大科技进展之首 与胚胎干细胞 一样 iPS细胞能够分化为各种类型的细胞 可应用 于组织或器官移植 建立疾病模型用于药物筛选等 方面 同时由于iPS细胞的获取不需要利用胚胎 从 而成功避免了核移植 胚胎干细胞所面临的伦理问 题 因此 作为实施再生医学和细胞治疗的重要细 胞来源 iPS细胞在生物和医学领域具有广泛的应用 前景 然而iPS技术在应用于临床试验之前 还面临 着诸多问题 其中引起科学家极大关注的问题之一 即iPS的多能性与安全性问题 尽管早在2007年便 已证明iPS细胞能够嵌合到生殖嵴 4 证明iPS细胞 具有一定的多能性 然而iPS细胞一直未能通过鉴定 多能性细胞发育能力的黄金标准 四倍体补偿实 验的验证 5 利用iPS细胞进行四倍体补偿实验获得 的iPS胚胎只能发育到原肠期的中期 从未有发育成 活体iPS小鼠 这说明iPS细胞与胚胎干细胞相比 在发育能力上具有较大差异 由于iPS细胞是通过 对体细胞进行重编程而获得 研究人员推测产生这 种差异的主要原因是重编程不完全 从而导致iPS细 胞处于一个异常的表观遗传状态 而这种异常是导 致癌症的因素之一 因此认为iPS细胞具有致癌的风 险 对于这个非常重要的问题 我们很想知道有没 有可能获得完全重编程的iPS细胞 以及通过什么样 的手段可以去监测iPS的安全性问题 为回答以上问题 根据我们在体细胞核移植以 及重编程领域的研究基础 设计了我们的实验 本 研究组已有的实验结果表明 Knockout血清替代物 KOSR 能提高小鼠胚胎的建系效率 6 此外 Blel2 loch R等发现KOSR可以加速iPS克隆的形成 7 体细胞核移植研究表明 移植后的体细胞核利用3 4天即可达到完全重编程的状态 因此我们设计通 过在培养液中添加KOSR或FBS 研究KOSR是否能 提高iPS细胞的诱导效率 诱导得到的iPS细胞是否 完全重编程 利用此类iPS细胞能否通过四倍体补偿 实验获得iPS小鼠 1994 2010 China Academic Journal Electronic Publishing House All rights reserved 中国基础科学 研究进展 2010 3 China Basic Science 19 通过利用二次感染提高感染效率 并优化诱导 方案后 我们发现 在KOSR添加组中 早在感染后 第10天即能观察到Oct4基因激活的iPS克隆 而添 加FBS的对照组直到感染后第32天才出现Oct4基 因激活的iPS克隆 这证实KOSR的确能够加速iPS 克隆的形成 进一步研究表明 在第14天时挑取iPS D142 iPS 克隆 可以高效地 6 6 建立稳定的iPS 细胞系 体内实验表明这些iPS细胞 4 4 可以嵌合 到生殖嵴 嵌合效率高于更长时间 D20与D36 诱 导得到的iPS克隆 我们共获得了37株遗传背景为 B6D2F1和C57 129S2稳定的iPS细胞系 检测表 明 iPS细胞能够表达多能性标志 例如Oct4 N anog 及SSEA1 具有正常的染色体核型 对其中3个iPS 细胞系的Oct4 N anog启动子区域的甲基化状态进行 检测后 发现与正常ES细胞一样都处于低甲基化的 状态 表明在重编程过程中发生了表观遗传重建 将 iPS细胞注射入裸鼠后对产生的畸胎瘤进行组织学 检测发现其能够产生完整的3个胚层 在一定程度 上说明了iPS细胞的多能性 利用四倍体补偿实验 我们进一步检测了iPS细胞是否被完全重编程 通 过将iPS细胞注射到四倍体囊胚 观察胚胎发育到期 情况 结果表明 D142iPS细胞获得37只到期小鼠 而D202 或D362iPS细胞都很难获得到期小鼠 我们 把第一只出生的四倍体补偿小鼠命名为 小小 Ti 2 ny 8 这只小鼠存活至今已经57周龄 依然十分活 跃 到目前为止 本实验获得的iPS四倍体补偿小鼠 已经通过繁殖获得了上百只子代及第三代 为进行 iPS细胞安全性的研究提供了平台 9 我们的实验回答了关于 iPS细胞是否具有与胚 胎干细胞相同的多能性 这一从iPS细胞出现以来 一直困扰着研究人员的问题 通过实验 我们在世 界上首次证明了iPS细胞可以达到完全重编程的状 态 能够分化为躯体的各种细胞组织 具有与胚胎干 细胞一样的多能性 为iPS技术的应用提供了理论基 础 同时 小小 的出生也提示我们将来可以通过 结合iPS技术与胚胎操作技术获得iPS动物 为当前 非常困难的转基因大动物模型的建立提供了新的思 路 更具有现实意义的是 我们可以通过长期监测 iPS小鼠的各项生理指标 肿瘤发生 子代发育等情 况 为解答iPS细胞的安全性问题提供可靠的依据 小小 代表着娇小和可爱 同时它也表明 小 小 的生命体可以体现出巨大的科学价值 对于iPS 技术 我们认为它不仅是作为研究细胞重编程的重 要工具 为重编程研究提供研究模型 同时为深入理 解人类疾病产生的根源以及治疗疾病提供途径 我 们希望为推动干细胞研究领域发展的这一小步 能 够在未来转化成为再生医学发展的一大步 该项成 果近日入选了 时代周刊 TI M E 2009年十大医学 突破 克隆 多莉 羊的罗斯林研究所发育生物学 部主任 国际学术期刊 转基因研究 主编布鲁斯 怀特洛认为 iPS细胞是一场革命 而 小小 宣布了 这场革命的胜利 他评价说 大多数研究都是小步 进展 而 小小 是一次飞跃 中国科学家做到了世 界上许多其他科学家没有做到的事情 他们应该因 此成就而享有声誉 并说 在克隆的道路上 小 小 接过了 多利 点燃的火炬 参考文献 1 Takahashi K Yamanaka S Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors Cell 2006 126 4 663 676 2 Takahashi K Tanabe K OhnukiM et al Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors Cell 2007 131 5 861 872 3 Yu J VodyanikM A Smuga2Otto K et al Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells Science 2007 318 5858 1917 1920 4 Okita K Ichisaka T Yamanaka S Generation of ger mline2competent induced pluripotent stem cells Nature 2007 448 7151 313 317 5 Jaenisch R Young R Stem cells the molecular circuitry of pluripo2 tency and nuclear reprogramming Cell 2008 132 4 567 582 6 Cheng J Dutra A Takesono A Garrett2Beal L Schwartzberg P L I mproved generation of C57BL 6J mouse embryonic stem cells in a defined serum2free media Genesis 2004 39 2 100 104 7 Blelloch R VenereM Yen J Ramalho2SantosM Generation of in2 duced pluripotent stem cells in the absence of drug selection Cell Stem Cell 2007 1 3 245 247 8 Cyranoski D Mice made from induced stem cells Nature 2009 460 7255 560 9 Zhao X Y LiW Lv Z et al iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation Nature 2009 461 86 90 i Ps Cells Produce Viable M icethrough Tetrap loid Com p lem enta tion Zhou Q i State Key Laboratory of Reproductive B iology SKLRB Institute of Zoology CAS Beijing100101 1994 2010 China Academic Journal Electronic Publishing House All rights reserved 中国基础科学 研究进展 2010 3 China Basic Science 20 Zeng Fanyi Shanghai Jiao Tong U niversity School ofM edicine Shanghai200025 We used viral vectors to introduce four genes into mouse fibroblast cells to reprogram these somatic cells into pluripotent cell in order to create iPS cells After carrying out a standard set of tests to check whether the reprogramming had worked our research group con2 firmed that we have generated 37 iPS cell lines Then we tested the pluripotency of these iPS cell lines by tetraploid complementation and 6 of 37 iPS cell lines generated 27 live mice 12 mice that were mated pro2 duced healthy offspring and for now they have got hundreds of second generation and more than 100 third2generation mice which were healthy and viable Keywords induced pluripote