叶绿素的测定(分光光度法).doc

中华人民共和国行业标准叶绿素的测定（分光光度法）881994Determination of chlorophyII（Spectrophotometric method）水利部19950501批准19950501实施1 总则1.1 主题内容本标准规定了用分光光度法测定水体中的叶绿素。1.2 适用范围本标准适用于河流、湖泊、水库或池塘等水体中叶绿素的测定。1.3 干扰及消除1.3.1 脱镁叶绿素能够干扰叶绿素的测定，当含有脱镁叶绿素时叶绿素的测定值偏高。因此，在测定叶绿素的时候，还要测定脱镁叶绿素1.3.2 脱镁叶绿素对叶绿素的干扰，可通过测定叶绿素酸化前后产生的吸收峰之比，对表观叶绿素的浓度作脱镁叶绿素的校正。2 原理将一定量的试样用微孔滤膜过滤，收集植物性浮游生物，用90%的丙酮溶液提取。将提取液离心分离后，测定750、663、645、630的吸光度，计算叶绿素的浓度。3 仪器3.1分光光度计。3.2比色池：10和50。3.3医用离心机。3.4离心管：1015带塞刻度管。3.5研钵：直径约80。3.6过滤装置：过滤器，微孔滤膜（孔径0.45，直径60），真空泵（吸气泵或蠕动泵）。3.7 常用实验设备。4 试剂4.1 碳酸镁悬浮液：1%（）。称取1.0细粉末碳酸镁（3）悬浮于100蒸馏水中。每次使用时，要充分摇匀。4.2 丙酮溶液：90%（）。在900丙酮中加100蒸馏水。4.3 盐酸溶液：1。量取83盐酸（1.19）溶于水中，冷却并稀释至1000。5 样品的采集与保存5.1 样品应按浮游植物定量采样方法，采集在玻璃或聚乙烯瓶子里。河流、湖泊、水库取500，池塘取300。5.2 采样后，样品应放在荫凉处，避免日光直射，最好立即对水样进行分析处理。如需放置水样，则应避光冷藏保存（25），而且每升水样需加11%碳酸镁悬浮液，以防止酸化引起色素溶解。6 步骤6.1 浓缩：在一定量的试样中添加0.2碳酸镁悬浮液，充分搅匀后，用直径60的微孔滤膜吸滤。过滤器内无水分后，还要继续抽吸几分钟。如果要延时提取，可把载有浓缩样品的滤膜放在干燥器里冷冻避光贮存。6.2 提取：将载有浓缩样品的滤膜放入研钵中，加入3丙酮溶液（4.2）至滤纸浸湿的程度，把滤膜研碎，再少量地加90%的丙酮溶液，把滤膜完全研碎，然后用90%丙酮溶液将已磨碎的滤膜和丙酮溶液洗入带刻度的带塞离心管中，使离心管内提取液的总体积不超过6，盖上管塞，置于4的暗处浸泡24。6.3 离心：将离心管放入离心机中，以4000速度离心分离20。将上清液移入标定过的10具塞刻度管中，加少量90%丙酮溶液于原提取液的离心管中，再次悬浮沉淀物并离心，合并上清液。此操作重复23次，直至沉淀不含色素为止，最后将上清液定容至10。6.4 测定：取上清液于10或50的比色池中，以90%丙酮溶液为对照溶液，读取波长750，663，645和630的吸光度。选择比色池的光程长度或稀释度，使其光密度663大于0.2，小于1.0。7 结果表示从各波长的吸光度中减去波长750的吸光度，作为已校正过的吸光度，按下式计算叶绿素的浓度： 8 注意事项8.1 使用的玻璃器皿和比色皿均应清洁、干燥、无酸，不要用酸浸泡或洗涤。8.2 750处的吸光度读数用来校正混浊度。由于在750的提取液的吸光度对丙酮与水之比的变化非常敏感，因此对于丙酮提取液的配制要严格遵守90份丙酮比10份水（体积比）的配比。8.3 使用斜头离心机时，容易产生二次悬浮沉淀物。为了减少这一困难，使用外旋式离心机头，在离心之前瞬间加入过量的碳酸镁。8.4 在研钵中用90%丙酮溶液提取叶绿素时，如果研磨操作进行不充分，就不能完全提取出来。也可以用外筒玻璃代替研钵，研棒用特氟隆制的匀化器。8.5 因为叶绿素提取液对光敏感，故提取操作等要尽量在微弱的光照下进行。8.6 吸收池事先要用90%丙