PCR定量丙肝RNA作业指导书.doc

丙型肝炎病毒(HCV)核酸扩增(PCR)荧光定量检测标准操作程序一、目的：明确丙肝病毒核酸定量检测的操作规程，指导检验人员正确进行丙肝病毒核酸定量的检测,保证检测结果及时可靠。二、范围：适用于进行丙肝病毒核酸定量检测的检验人员。三、职责：实验操作人员应严格按操作规程进行实验。四、检测原理：本试剂盒从血清或血浆中提取HCV RNA，在逆转录酶作用下将RNA逆转录为HCV cDNA，在引物的指导下，以四种脱氧核苷酸为底物，通过耐热DNA聚合酶的酶促作用，对cDNA进行体外扩增，用Taqman探针法检测扩增产物。通过标准曲线，即可计算出被检物的含量。 五、试剂：1. 来源：上海复星HCV核酸扩增荧光定量检测试剂盒。2. 规格：32人份/盒。3. 试剂盒组成：3.1 病毒RNA提取试剂：用于从血清或血浆中提取HCV RNA。 裂解液 4ml1瓶 含有硫氰酸胍的溶液 助沉剂 1瓶 含有助沉剂的冻干粉末 去抑制剂 1瓶 含有去抑制剂的冻干粉末 洗涤液A 14ml1瓶 含有硫氰酸胍的溶液 洗涤液B 4ml1瓶 含有Tris的溶液 洗脱液 洗脱液 12支 含0.04% NaN3的灭菌双蒸水（无RNase） 核酸提取柱 32支1包 含连接套管3.2 核酸扩增（PCR） 荧光检测试剂： RTPCR试剂 PCR主反应液 250ul1支 含有一对引物和dNTP的溶液 酶混合物 酶混合物 180ul1支 含有Taq酶、逆转录酶和RNA酶抑 制剂的溶液 荧光探针 荧光探针 20ul1支 含有荧光探针的溶液250ul1支 阴性对照 含有0.05% NaN3的HCV RNA阴性的混和人血清 对照品 阴性对照 强阳性对照 强阳性对照 250ul1支 含有约2106 IU/ml的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA 弱阳性对照 弱阳性对照 250ul1支 含有约2104 IU/ml的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA 工作标准品 工作标准品1 250ul1支 含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA 工作标准品 工作标准品2 250ul1支 含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA 工作标准品 工作标准品3 250ul1支 含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA 工作标准品 工作标准品4 250ul1支 含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA 工作标准品的参数和强、弱阳性对照的定值允许范围根据批号不同而不同。详见试剂盒的说明书附页。六、仪器：SLAN6.0Real-Time PCR Detection七、操作程序1、样本处理（标本处理区进行）标本处理（所有操作需采用无RNA酶的带滤芯吸嘴及离心管，在标本处理区进行）1.1试验前准备1.1.1将裂解液置70加热5分钟，使试剂瓶内的结晶全部溶解。吸取1ml裂解液加到助沉剂的试剂瓶中，用吸嘴搅动，混匀后全部吸回到裂解液瓶中，混匀后备用。 1.1.2 在去抑制剂的试剂瓶中加入700ul洗脱液，用吸嘴搅动，溶解后混匀备用。1.1.3 在洗涤液A的瓶子中加入6ml无水乙醇，颠倒混匀后备用。1.1.4 在洗涤液B的瓶子中加入16ml无水乙醇，颠倒混匀后备用。1.2 病毒RNA提取 1.2.1取n个0.5ml离心管（n标本数量+阴性对照、强阳性对照、弱阳性对照和4个工作标准品），做好标记后分别加入100ul已混有助沉剂的裂解液。 1.2.2分别用带滤芯吸嘴加入100 ul需处理的血清或血浆标本和对照品，用带滤芯吸嘴反复吹打5次。 1.2.3 再分别用带滤芯吸嘴加入20 ul 去抑制剂，盖上管盖，振荡混匀，离心数秒，置70反应10分钟。 1.2.4 离心数秒，用带滤芯吸嘴加入110ul无水乙醇，振荡混匀，离心数秒。 1.2.5 将做好标记的核酸提取柱插入连接管后，固定在负压装置上，将步骤2.4中的所有液体小心移入核酸提取柱。注意不要将液体溅入其它样品的核酸提取柱内。1.2.6 开启负压，让核酸提取柱内的液体全部抽干。 1.2.7 在每个核酸提取柱内加入500ul洗涤液A，开启负压，让核酸提取柱内的液体全部抽干。1.2.8 在每个核酸提取柱内加入500ul洗涤液B，开启负压，让核酸提取柱内的液体全部抽干。1.2.9从连接套管上取下核酸提取柱，将其放入无RNA 酶的2ml离心管中，盖上管盖，14000rpm离心1分钟。1.2.10将提取柱放入一新的2ml离心管中（确保采用无RNA酶的离心管），小心将50ul洗脱液加在柱面中央，静置1分钟。1.2.11盖上管盖，10000rpm离心1分钟，取2ml离心管中的收集液12.5ul 做PCR反应模板。2、RTPCR试剂准备（PCR前准备区进行） 从试剂盒中取出PCR主反应液、酶混合物和荧光探针，室温下融化后离心数秒，按照待扩增标本数量X ，取PCR主反应液：酶混合物：荧光探针=750.5混合，加入一适当体积离心管中，充分混匀后离心数秒，分装至PCR毛细反应管中，每管12.5ul，将装有PCR反应液的毛细反应管转移至标本处理区。3、加样（标本处理区进行）3.1 在装有PCR反应液的毛细反应管中用带滤芯吸嘴分别加入12 .5ul已处理好的标本（标本处理步骤2.11离心管中的洗脱液）。3.2 盖上管盖，离心数秒后转移至扩增检测区。4、PCR扩增（扩增检测区进行）4.1 将毛细反应管放入LightCycler荧光PCR扩增仪进行扩增检测。4.2 样品设置 在仪器软件的相应样品设置窗口内填写各样品的名称、类型及工作标准品参数（见试剂盒内提示）。4.3荧光检测通道：F14.4循环参数设定： ProgramCyclesTemperatureTarget()Hold Time(min:sec)Slope(/sec)AcquisitionMode115025:0020None21942:0020None3593320None55152None721520None44293320None604520Single51403020None5、结果分析5.1 选F1或F1/F2通道，点击Quantification按钮，进入数据分析界面。5.2 在数据分析窗口中，将噪音线Noise Band的位置移至刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点，且CT值不出现任何数值为准(可根据仪器本身的实际情况加以调整),得到各标本的HCV RNA检测结果。6、质控标准 6.1 本试剂盒的定量线性范围：103测定结果107IU/ml。6.1 工作标准品标准曲线的相关系数| r |0.950。6.2 阴性对照的测定结果为0（结果不显示任何值）。6.3 强、弱阳性对照的定量结果在试剂盒提示的规定允许范围内。7结果判断 本试剂盒的检测灵敏度为500IU/ml，定量测定范围为103107IU/ml。 7.1 定性结果判断： 7.1.1测定结果为0(无数值)的标本为HCV RNA阴性标本。 7.1.2 测定结果500IU/ml的标本为HCV RNA阳性标本。7.2 定量结果判断： 7.2.1对于103测定结果107 IU/ml的样本，提示本次测定结果在试剂盒有效定量检测线性范围内。报告上注明其测定结果。 7.2.2对于测定结果107 IU/ml的样本，提示病毒含量高于试剂盒定量检测线性范围上限，所测结果仅供参考，报告上注明107