Survivin mRNA在胃癌外周血中的表达及临床意义.pdf

中国癌 症杂志 2 0 1 0 年第2 o 卷第1 2 期 C HI N A O N C OL O G Y 2 01 0 V o 1 2 O N o 1 2 9 0 3 S u r v i v i n mRNA 在 胃癌外周血中的表达 及 临床 意义 摘要 背景与目的 S u r v i v i n 在肿瘤的发生 发展中起重要作用 近年来 S u r v i v i n 在胃癌研究领域 备受关注 本研究探讨S u r v i v i n m R N A 在胃癌外周血中的表达及其临床意义 方法 以G A P D H 作内参照 应用实 时定量R T P C R 技术检测胃炎及化疗前胃癌各5 O 例外周血中S u r v i v i n m R N A 表达水平 结果 正常对照组 胃炎患 者 外周血中未检测到s u r v i v i n m R N A 表达 胃癌组患者S u r v i v i n 表达检测率为8 6 4 3 例 其中2 8 例出现转移 的患者阳性率为1 0 0 2 2 例未出现转移者为6 8 2 P O 0 5 回归分析发现 S u r v i v i n m R N A 的表达水平是影 响 胃癌预后的独立预测因素 结论 外 周血S u r v i v i n m H N A 可作为临床评估 胃癌患者预后的客观指标之一 关键词 胃肿瘤 外周血 S u r v i v i n m R N A 预后 中图分类号 R 7 3 5 2 文献标识码 A 文章编号 1 0 0 7 3 6 3 9 2 0 1 0 1 2 0 9 0 3 0 4 The e x p r e s s i o n o f s u r v i v i n mRNA i n t he p e r i ph e r a l b l o o d o f g a s t r i c c a nc e r a n d i t s c l i n i c a l s i g n i fi c a n c e D E N G J i a D z h o n g J I N J i a n h u a L U W e n b i n w A N G F a n g D e p a r t m e nt o f M e d i c a l O n c o l o g y lf u j i n H o s p i t a l A f f i l i a t e d t o J i a n g s u U n i v e r s i t y C h a n g z h o u J i a n g s u 2 1 3 0 0 2 C h i n a C o r r e s p o n d e n c e t O J I N J i a n h u a E m a i l j j h j j h 2 0 0 7 1 6 3 c o m Ab s t r a c t B a c k g r o u n d a n d p u r p o s e R e c e n t l y p i v o t a l s t u d i e s h a v e e x t e n s i v e l y i n v e s t i g a t e d t h e r o l e o f t h e s u r v i v i n g e n e i n g a s t r i c c a n c e r s Th i s s t u d y a i me d t o i n v e s t i g a t e t h e c l i n i c a l s i g n i fi c a n c e o f t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f s u r v i v i n mRNA i n t h e p e r i p h e r a l b l o o d o f g a s t r i c c a n c e r s M e t h o d s Th e e x p r e s s i o n 1 e v e l s o f s u r v i v i n mR NA i n t h e p e ri p h e r a l b l o o d o f g a s t r i c c a n c e r a n d g a s t r i t i s we r e d e t e c t e d b y Re a l t i me q u a n t i t a t i v e r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n p o l y me r a s e c h a i n r e a c t i o n R T P C R w h i l e G AP DH w a s u s e d a s a n i n t e ma 1 r e f e r e n c e g e n e Re s u l t s S p e c i me n f r o m g a s t r i t i s p a t i e n t s a n d g a s t r i c c a n c e r p a t i e n t s i n d i c a t e d e x p r e s s i o n r a t e s f r o m s u r v i v i n mR NA a s O a n d 8 6 T h e e x p r e s s i o n o f s u r v i v i n mR N A s h o w e d n o c o r r e l a t i o n wi t h a g e g e n d e r o r l y mp h n o d e me t a s t a s i s P 0 0 5 b u t wa s s i g n i fi c a n t d i ff e r e n t i n t h e T NM s t a g e f P O 0 5 T h e C O X s t e p wi s e p r o p o r t i o n a l h a z a r d s a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f s u r v i v i n mRNA r e ma i n e d s i g n i fi c a n t l y i n d e p e n d e n t d u r i n g p r o g n o s i s Co n c l u s i o n Th e e x p r e s s i o n l e v e l s o f s u r v i v i n mRNA wa s o v e r e x p r e s s e d i n t h e p e r i p h e r a l b l o o d o f g a s t r i c c a n c e r T h e s e e x p r e s s i o n l e v e l s ma y a l s o b e a n i mp o r t a n t ma r k e r f o r p r o g n o s i s for g a s t r i c c a n c e r p a t i e n t s Ke y wo r d s G a s t r i c c a r c i n o ma P e ri p h e r a l b l o o d S u r v i v i n mR NA P r o g n o s i s S u r v i v i n 于1 9 9 7 年由A m b r 0 s i n i 等 利用效 讨外周血S u r v i v i n m R N A 的 表达水平与胃癌发 应细胞蛋白酶受体一 l e ff e c t o r c e l l p r o t e a s e r e c e p 一 生 发展的作用及临床意义 to r l E P R 1 的c D N A 在人类基因组库中筛选克 隆 具有抑制细胞凋亡 调控细胞周期及参与 l 资料和方法 血管形成的作用 胃癌因其早期症状不明显 大多数患者被确诊时病程 已至进展期 检测外 1 1 临床资料 周血中S u r v i v i n 的表达 有可能成为检测肿瘤转 选择2 0 0 7 年l 0 月一2 0 0 9 年6 月到江苏大学附 移及判断预后的参考指标之一 本研究旨在探 属武进医院肿瘤科 消化内科和外科就诊并经 基金项 目 江苏省常州 市武进 区科技局资助 项 目 N o W S 2 0 0 9 0 0 7 通讯作者 金建华E ma i l j j h j j h 2 0 0 7 l 6 3 c o m 邓建忠 等 S u r v i v i n m R N A 在胃癌夕 星 中的 姿 童 胃镜活检及术后病理确诊为胃癌的患者5 O 例 转 移2 8 例 未转移2 2 例 同时平行选择年龄性别 相匹配的门诊慢性胃炎患者5 0 例 所有患者均 知情 同意 实验组病例为 胃癌患者 共5 0 例 其中男 性2 8 例 转移1 6 例 未转移l 2 例 女性2 2 例 转 移l 2 例 未转移l 0 例 年龄3 4 7 2 岁 中位年龄 5 8 岁 T N M分期 I 期3 例 期8 例 m期 l 1 例 期2 8 例 采用2 0 0 2 年第6 版A J C C 胃癌 T N M分期标准进行分期 对照组病例为 胃炎患 者 共5 0 例 其中男性3 0 例 女性2 0 例 年龄 3 0 6 8 岁 中位年龄5 4 岁 1 2 方法 1 2 1 外周血总RNA的提取 完整性和 纯度检 测 根据试剂盒操作说明 应用T R I z o l R e a g a n t 行提取R N A 所提取的总R N A 用紫外分光光度 计定量并检测其纯度 A A I 8 为合格 所提取 的总RNA完整性经琼 脂糖 电泳 鉴定 一 7 0 c C 保存待用 1 2 2 c DNA 合成2 0 L 反应体系中含 总 R N A l g 1 0 缓冲液2 L d N T P s 1 0 m m o l L 2 L 随秽 L 弓 l 物l 0 0 n g M M L V 1 0 U L 2 L J J II D E P C 液至2 0 L 逆转录反应条件 为 3 7 6 0 m i n 9 5 o C 5 m i n 一 7 0 保存 待用 1 2 3 实时荧光 定量P CRf RT P CR 检 测 利用D N A ma n 软件设计R T P C R S u r v i v i n 和管 家基因G A P D H的引物 G A P D H上游引物为 5 一 G A A G G T G A A G G T C G G A G T C 一 3 下游引物 为5 一 GA AGA T G G T GA T GG GA T T T C 一 3 探 针 序歹 0 为5 一 C AAGC T T C CC GT T C T C AGC C 一 3 S u r v i v i 13 上游引物为5 一 T GC C C C G A C G T T GC C 一 3 下游 引物为5 一 C AG T T C T T G AA T G T A G A G A T G C G G T 一 3 探针序列为5 一 C C T G GC AGC C C T T T C T C AA GGA C C 一 3 用R T P C R 法检测患者外周血中S u r v i v i n m R N A 的表达水 平 G A P D H为内参照 P C R 试剂盒 引物及 探针合成由中山医科大学达安基因有限公司提 供 5 0 L R T P C R 反应体系中含 1 定量 缓冲液 2 0 0 m d N T P s 5 U a m p l i T a q G o l d S u r v i v i n 上 下游引物各6 0 0 n m o l L 荧光探针 2 0 0 n m o l L 1 0 0 n g c D N A 反应条件为 5 0 c C 1 0 S 9 5 c C 1 0 mi n 然后 9 5 3 0 s 6 0 1 mi n 共4 0 个循环 P C R 反应结束后 根据 标准曲线仪器 自动进行分析 对每份标本均 设副孑 L 采用G A P D H为内参基因 以S u r v i v i n G A P D H f J J 比值计算 待测样品的拷贝数 1 2 4 统计学处理应用S P S S 1 3 0 统计软件包 进行统计学处理 计数资料采用 检验 生存 曲线用K a p l a n M e i e r 法建立 与生存时间的关 系用L o g r a n k 检验 用C o x 比例风险模型评估 影响预后生存的各变量 采用双侧检验进行处 理 检验水准 0 0 5 P O 0 5 为差异有统计学 意 义 2 结 果 2 1 S u r v i v i n mRNA 检测结果 正常对照组 胃炎患者 外周血中未检测到 S u r v i v i n m R N A 表达 胃癌组患者S u r v i v i n 表达 检测率为8 6 4 3 例 其中2 8 例转移患者的阳性 率为1 0 0 2 2 例未转移的为6 8 2 尸 0 0 5 表 1 1 袭 1 S u r v i v i n 表达与胄癌临床病理学 因素之间的关系 Ta b 1 Th e r e l a t i o n s hi p b e t we e n S ur v i v i n e x pr e s s i o n l e v e l a n d c I i n j c 0 p a t h 0 l 0 g i c f e a t u r e s 2 3 预后因素分析 运用C O X回归模型对可能影响胃癌患者预 后 的各种 因素 包括年龄 性别 淋 巴结转 移 S u r v i v in 表达及病理分期等进行回归分析 分析结果显示 病理分期 S u r v i v i n m R N A 的表 达水平是影响胃癌预后的独立预测因素 表2 中国癌 症杂 志 2 0 1 0 年第2 0 卷第1 2 期 表 2 COX 模型筛选的胃癌 危险因素及其参数 T a b 2 M u l t i v ar i a t e a na l y s i s o f p r o g no s t i c f a c t o r s byCOX m o d e l 905 V a r i a b l e s B s E RR S t a g e O 9 4 2 0 4 4 6 4 4 6 3 S u r v i v i n 4 2 8 6 1 2 6 4 I 1 5 0 0 0 0 3 5 O 0 O l 3 讨 论 S u r v i v i n 基因定位于染色体1 7 q 2 5 是凋亡 抑制蛋白fi n h i b it o r o f a p o p t o t i c p r o t e i n I A P 家族 中的新成员 l A P 家族的所有成员都具有一个 共 同的特征 即含有 一个有 1 3 个拷 贝的包括 7 O 个氨基酸残基的杆状病毒I A P 重复序 1 b a c u l o v i ms I A P r e p e a t B I R 1 B I R 功能区是发挥功 能的主要结构 I A P 具有显著的抑制细胞凋亡 的效应 体外实验表明 S u r v i v i n 可以与效应 细胞死亡蛋白酶c a s p a s e 一 3 和c a s p a s e 一 7 结合 抑 制细胞凋亡 并抑制由F a s B a x 抗癌药物诱 导的细胞凋亡 胃癌是化疗相对敏感的肿 瘤 多种抗癌药物治疗肿瘤的原理是通过凋亡 途径导致肿瘤细胞死亡 这提示凋亡抑制基因 S u r v iv i n 可作为胃癌患者对于化疗是否敏感的指 标之一 从而指导肿瘤的个体化治疗 S u r v iv i n 基因在肿瘤研究领域备受关注 S u r v i v i n 表达于 胚胎和发育的胎儿组织 但较少表达于正常成 人的终末分化组织 S u r v i v i n 选择性地在肿瘤中 表达 目前已发现结肠癌 胃癌 食管癌 非 小细胞肺癌等肿瘤 中有S u r v i v i n 的表达 J 有研究表明S u r v i v i n 在 胃癌组织中1 0 0 表达 而在 胃癌周围正常组织 中几乎不表达 但 姚学权等 利用免疫组化s P 法检 lJ S u r v i v i n 在 胃腺癌中的表达 结果显示 胃癌原发灶 淋 巴结转移癌细胞及正常腺体基底生发层细胞的 S u r v i v i n 的阳性表达率分别为4 9 2 6 4 0 和 l 7 5 目前国内检测s u r v i v i n 常采用 的是肿瘤组 织及免疫组化的方法 而要对胃癌不同治疗阶 段进行监测 了解化疗时药物对肿瘤细胞诱导 凋亡作用 仅仅检测胃癌组织中S u r v i v i n 的表达 是不够的 需要采用新的途径和更好的检测方 法 寻找敏感和特异的无创性方法监测 胃癌是 当前的研究热点 外周血作为肿瘤细胞转移的 载体 是血行转移的必要条件 实时荧光定量 R T P C R 技术可以较准确地检测肿瘤患者外周 血中肿瘤细胞的存在水平 本研究显示 正常对照组外周血未检测到 S u r v i v in m R N A 的表达 我们认为可能是由于患 者外周血中肿瘤细胞的数量不足以促使S u r v i v i n 表达 就被机体正常的免疫系统所抑制或消 灭 而我们发现所有有远处转移的胃癌患者 S u r v i v i n 均表达 能更好说明S u r v i v i n 对抑制癌 细胞凋亡的作用 在胃癌组患者中S u r v i v i n 表 达检测率为8 6 0 而那些早期或局部晚期的 胃癌患者S u r v i v i n 的表达率为6 8 2 较B e r t a z z a 等 报道的9 8 6 低 两者相比 有远处转移 胃癌患者的S u r v i v i n 表达率明显增高 P 0 0 5 以上结果表明随着肿瘤病期的增 加 S u r v i v i n 表达水平升高 提示S u r v i v i n 的表 达在肿瘤 的侵袭和血行转移过程中起一定作 用 本研究结果与S o n g 等 的研究结果基本相 似 仅肿块大小的临床病理特征与S u r v i v i n表 达有关 而与年龄 性别 淋巴结转移无相关 性 但与Y i e 等 报道的浸润深度 淋巴结转 移状态及疾病分期与S u r v i v i n m R N A 表达有关的 研究结果不同 我们认为这也可能是由于彼此 所使用的检测方法及入组的个体差异有关 C O X 回归模型对可能影响胃癌患者预后的 因素进行 回归分析 结果发现 肿瘤分期 S u r v i v i n m R N A 的表达水平是影响胃癌预后的独 立因素 表明S u r v i v i n 对 胃癌的发生 发展影响 显著 且外周血S u r v i v i n 的检测可作为临床评估 胃癌患者预后的客观指标 总之 实时荧 光定量 R T P C R技术 检测肿 瘤患者外周血中肿瘤细胞的水平是一种敏感而 又特异的无创伤方法 S u r v i v i n 作为新的凋亡抑 制蛋 白 对胃癌的发生 发展的影响重大 采 用实时荧光定量R T P C R 法检测 胃癌外周血中 S u r v i v i n m R N A 表达水平 对胃癌复发 转移的 检测和预后判断具有一定价值 参考文献 愀 帅 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一一 一 州 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 9 0 6 建昼 i 13 m R N A 在胃癌外周血中的表 达及临床意义 4 i t s c l i n i e o p a t h o l o g i e p a r a m e t e r s J J Z h i a n g U n i v S e i B 2 0 0 9 1 O 9 6 7 5 68 2 Be r t a z z a L Mo c e l l i n S Ma r c h e t A e t a 1 Su r v i v i n g e n e l e v e l s i n t h e p e r i ph e r a l b l o o d o f p a t i e n t s wi t h g a s t r i c c a n c e r i n d e p e n d e n t l y p r e d i c t s u r v iv a l J J Tr a n s l Me d 2 0 0 9 2 2 7 1 1 1 7 8 5 Ho f f ma n n AC Va l l b 6 h me r D G r i mmi n g e r P e t a 1 9 6 P r e o p e r a t i v e s u r v i v i n mRNA d e t e c t i o n i n p e r i p h e r a l b l c o d i s a n i n d e p e n d e n t p r e d i c t o r o f o u t c o me i n e s o p h a g e a l e a r e i no ma l J j P 11 a r ma o g e n 0 mi c s 2 0 1 0 1 1 f 3 1 3 4 1 3 4 7 Kr e p e l a E Da nk o v a P Mo r a v c i k o v a E e t a 1 I n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f i n h i bi t o r o f a p o p t o s i s p r o t e i ns s u r v i v i n a n d X I A P i n n o n s ma l l c e l l l u n g c a r c i n o ma J I n t J On e o 1 2 0 0 9 3 5 f 6 1 1 4 4 9 1 4