酵母准备试剂.doc

酵母转化(一) 材料、仪器设备及试剂：1. 0.2% stock solution 的 L-Adenine Hemisulphate：0.2g+100ml的ddH20，分2支 用时灭菌。2.YPDA培养基： 1Ll 胰蛋白胨 20g/Ll 酵母提取物 10g/Ll 葡萄糖 20g/Ll 腺嘌呤 15ml 0.2% stock solutionl 调节pH =7.5，121灭菌15min 3.YPDA培养基 （用时再分装灭菌）YPDA Liquid (1 L)ReagentAmountYPD50 gL-Adenine Hemisulphate15 ml of 0.2% stock solutionDeionized waterUp to 1 LAdjust pH to 6.5 if necessary, then autoclave.3. YPDA Agar培养板(1 L)ReagentAmountYPD agar70 gL-adenine hemisulphate15 ml of 0.2% stock solutionDeionized waterUp to 1 LAdjust pH to 6.5 if necessary, then autoclave.4.0.9%NaCl（w/v）（科室拿） 1ml:EP管分装NaCl: 0.9gmilipore水 定容到100ml灭菌121，20min5.100%DMSO 从试剂瓶中分装到ep管中，500ul每管，室温保存6. 10TE（pH=7.5）： （0.1M Tris-HCl，10mM EDTA）l Tris-HCl 1.211g/100ml l EDTA0.37g/100mll 调节pH=7.5, 121，20min7. 10LiAc（pH=7.5）l 1M LiAc10.202g/100mll 用醋酸调节pH=7.5，121灭菌20min1. 1.1TE/LiAc1.1ml的10TE + 1.1ml的 10LiAc 加入灭菌水终为10ml2. 50% PEG3350：l PEG3350： 50gl 已灭菌的milipore水： 定容到100ml （可用50水浴助溶，PEG易吸水，不可灭菌）3. PEG/LiAc：现配现用，在超净台中操作，吸取母液到ep管或50ml离心管中终浓度10mlPEG335040%8ml 50%PEG3350TEbuffer11ml 10TELiAc11ml 10LiAc4. 变性的鲱鱼精DNA(10mg/ml)： 100 5min 变性5. milipore水，70%酒精棉球，50ml离心管4个，ep管一盒，15ml试管架，50ml试管架，ep管架6.x-a-GAL用 DMF（dimethyl formamide） 20mg/ml，Prepare and autoclave 1 L of the appropriate droput agar mediumCool to 55C Add 2 ml of X-a-Gal (20 mg/ml)Spreading onto premade agar platesDilute X-a-Gal to 4 mg/ml in dimethyl formamideSpread 200 l onto 15 cm plates, or 100 l onto 10 cm plates using sterile glass beads (二) 具体方法： Freezing Medium consists of YPD liquid medium + 25% glycerol u A：酵母感受态制备1. 从平板上或保种管中，挑少许酵母，在YPDA平板上划单克隆（10ul+10ul的DDH20），30培养3天左右。2. 从平板上分别挑取单克隆（直径2-3mm）到含有3ml YPDA的玻璃试管中（平行做3管）3. 30，200rpm，培养8-12h （过夜）4. 取200ul 菌液，测OD6005. 选取OD600值最大的一个试管（即活力最高的一个），吸取5ul转移至50m新鲜的YPDA培养基中（培养基装在250ml三角瓶中） ？剩下的离心制作甘油菌6. 30，200rpm，培养16-20h，直至OD600=0.15-0.37. 将培养好的菌液转入2个50ml离心管，室温离心3000g，3min，弃上清，用100ml新鲜的YPDA悬起管底的菌体，并倒入干净的三角瓶中。8. 30，200rpm培养直到OD600=0.4-0.5（3-5小时）9. 将菌液倒入2个50ml离心管，室温离心，3000g，3min，弃上清，每个离心管用30ml 灭菌水重悬。10. 再次离心，3000g，3min，室温 弃上清，每管用1.5ml 1.1TE/LiAc重悬。11. 将重悬的菌液转移到2个ep管中，12000rpm，15s12. 弃上清，每管用600ul 1.1TE/LiAc重悬，将两管重悬菌液并入一管，准备进行转化。u B：酵母质粒转化 （pGBKT7。pGBKT7/n端和c端。）小规模转化大规模转化1. 加入质粒DNA（在预冷的EP管中） 100-500ng 3-5ug鲑鱼精DNA(变性的，10mg/ml)5ul 20ul加入感受态细胞, 轻弹混匀 50ul 600ul2. 加入PEG/LiAc, 轻弹混匀500ul 2.5ml3. 30水浴，每10-15min轻弹混匀30min 45min4. 加入DMSO, 轻弹混匀20ul 160ul5. 42水浴，每5-10min轻弹混匀15min 20min6. 离心，弃上清最大转速 3000g15s 3min7. 用液体YPDA培养基重悬1ml 3ml8. 30，230rpm，培养 90min 90min9. 离心，弃上清 最大转速 3000g15s 3min10. 用0.9%NaCl重悬1ml 15ml11. 涂板在相应的筛选培养基上。(三) 注意事项：1. 转化效率与很多因素有关，酵母活力是一个重要因素，一般制备酵母感受态的细胞必须是没有经过4保存的，活化过的，从培养箱中取出的新鲜酵母。2. 在制备酵母感受态时，不要超过上述的的OD值，要让酵母一直处在生长最旺盛的时期，特别是最后一次培养，OD600的值不要超过0.53. 酵母转化过程中，没有抗生素，极易染菌，所有实验都在超净台中进行，超净台需提前一天用70%酒精棉擦拭，将第二天用到的物品（如，试剂，试管，架子等）都放入超净台，灭菌过夜，每次进入超净台操作时，需用70%酒精棉擦手消毒。4. 由于酵母生长周期较长，平板一般在培养箱中要放3天左右，所以在倒板时，不可吹得太干，小板晾干10min左右，大板晾干15min左右即可5. 有些筛选培养基需要加入3-AT，必须是在培养基冷却到55一下才可加入。铺板（铺板3个一起做，转化后生长、自我激活、毒性对比）试剂准备：准备SD/-Trp板3*3=9个板 9*20=180ml200ml1.appropriate SD selection medium（）For pGBKT7, use SD/-Trp For pGADT7, use SD/-Leu2. 1/10 稀释：100ul目的载体+900ul YPDA 板3*3=9个板 9*20=180ml200ml 1/100稀释：10ul目的载体+990ul YPDA 1/5稀释： 10ul目的载体+40ul YPDA二、Spread 100 l of 1/10 and 1/100 dilution onto a 100 mm plate containing the appropriate SD selection medium三、Incubate plates upside down at 30C until colonies appear (35 days).3-5天后，挑取单菌落，5ml的缺陷液体培养基中培养12h（过夜），室温离心，3000g，3min。甘油菌制备 取500ul的（YPD+25%甘油）菌落自我激活和毒性1、自我激活1） 已准备好的AH109菌株：pGBKT7-cav3和N端，2） 阳性对照组：pGBKT7-53(AH109菌株) 和pGADT7-T3） SD/-Trp/ X-a-Gal plates在1L中，Cool to 55C,add 2 ml of X-a-Gal (20mg/ml).4） SD/-Ade/-His/-Trp/X-a-Gal plates 在1L中，Cool to 55C,add 2 ml of X-a-Gal (20mg/ml)2、实验过程：1.Spread 100 l of a 1/10 dilution and a 1/100 dilution of your transformation mixture onto separate:SD/-Trp/ X-a-Gal platesSD/-Ade/-His/-Trp/X-a-Gal plates2、Expected results after 35 days:毒性-中毒1.Materials:AH109 competent cells (Section XII.A)SD/-Trp agar plates (Appendix D)SD/-Trp liquid medium (Appendix D)2、Transform 100 ng of the following vectors using the small-scale transformation protocol (Section XII.B)pGBKT7 (empty)pGBKT7 + cloned bait gene3、Spread 100 l of 1/10 and 1/100 dilutions of your transformation mixtures onto SD/-Trp.4、Grow at 30C for 35 days:酵母双杂交一、 材料准备、转化后 bait strain 在菌株上长3-5天后1、 EP管，灭菌好的2L烧瓶；2、 Y187-library 3、 在SD-Trp板上培养的已经转化入AH109的pGBKT7-cav3/pGBKT7-cav3N端和C端4、 -SD/-Trp 液体培养基50ml（250ml烧瓶）+5ml5、 SD培养板-SD/-Trp 4中浓度*3=12个板 12*20ml=240Ml250ml-SD/-Leu培养板 4中浓度*2=8个板 8*20ml=160Ml150ml-SD/ -Leu/- Trp培养板 4中浓度*2=8个板 8*20ml=160Ml150ml-SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal 培养板32个板*20ml=640ml650ml在1L中，Cool to 55C,add 2 ml of X-a-Gal (20mg/ml)6、 2xYPDA liquid medium：45ml（50ug/ml kan） 7、 0.5xYPDA liquid medium 50ml（50ug/ml kan）+10ml=60ml 8、 Kanamycin sulfate (50 mg/ml)9、 YPD + 25% glycerol liquid (freezing) medium二、 实验过程：P18对照实验三、1、Prepare a concentrated overnight culture of the bait strain (AH109 pGBKT7+Bait) as follows: 1) Inoculate one fresh, large (23 mm) colony of your bait strain into 50 ml of SD/-Trp liquid medium.2) Incubate shaking (250270 rpm) at 30C until the OD600 reaches 0.8 (1620 hr).3) Centrifuge to pellet the cells (1,000 g for 5 min), discard the supernatant.4) Resuspend the pellet to a cell density of 1x108 cells per ml in SD/-Trp (45 ml). The cells can be counted using a hemocytometer血细胞计算器.2、Combine the Library Strain with the Bait Strain as follows:1) Thaw a 1 ml aliquot of your library strain in a room temperature water bath.取1ml在室温水浴下解冻。 Remove 10 l for titering on 100 mm SD/-Leu agar plates ( see Appendix B, Section B for library titering instructions).2) Combine the 1 ml of Library Strain with the 5 ml Bait Strain in a sterile 2 L flask.3) Add 45 ml of 2xYPDA liquid medium (with 50 g/ml kanamycin).4) Rinse冲洗 cells from the library vial小瓶 twice with 1 ml 2xYPDA and add to the 2 L flask.3、Incubate at 30C for 2024 hr, slowly shaking (3050 rpm).4、After 20 hr, check a drop of the culture under a phase contrast microscope (40X). If zygotes are present, continue to Step 8, if not, allow mating to continue, incubate for an additional 4 hr.Noteote : A zygote typically has a 3-lobed structure, the lobes represent the two haploid parental cells and the budding diploid cell.5. Centrifuge to pellet the cells (1,000 g for 10 min).6. Meanwhile rinse the 2L flask twice with 50 ml 0.5xYPDA (with 50 g/ml kanamycin), combine the rinses and use this to resuspend the pelleted cells. 7. Centrifuge to pellet the cells (1,000 g for 10 min) and discard the supernatant. 8. Resuspend all pelleteted cells in 10 ml of 0.5xYPDA/Kan liquid medium. Measure the total volume of cells + medium.Noteote : e.g., 10 ml medium + 1.5 ml cells = 11.5 ml10、 From the mated culture spread 100 l of 1/10, 1/100, 1/1,000, 1/10,000 dilutions on each of the following 100mm agar plates and incubate at 30C for 35 days.SD/-TrpSD/-LeuSD/-Leu/-Trp (DDO)11、 Plate the remainder of the culture, 200 l per 150 mm on SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal (QDO+X-a-Ga