高等植物DNA的提取和纯度鉴定.doc

高等植物DNA的提取和纯度鉴定总结报告药学院08级本科一班周正昌3008213029阙梦3008213030报告内容l 预实验情况l 实验中问题l 同学的意见l 我们的总结一、预实验情况（按实验日期排列）9.10实验情况此次是我们第一次正式实验先前培养了小麦，发现霉变现象。进行了基础的配液工作，将实验需要的试剂进行量取和称量。向老师学习了凝胶电泳的使用方法和凝胶的制作。处理：经过我们的讨论和询问老师得知小麦每天需要清洗才能保证霉菌被去除。（只需麦芽的生长速度快于霉菌即可）。初步确定了实验时需要的试剂的量和规格，和老师沟通，解决实验时药品供应。9.11实验情况实验任务：完成第一次DNA的提取。实验过程：小麦芽已经部分长成，摘取合适长度的小麦芽进行实验，其他的小麦芽继续放入恒温箱培养。实验时由于在液氮研磨过程中缺乏液氮保护，造成研磨时小麦芽不能成细分状。（此现象会对实验结果产生影响）按步骤完成实验的提取过程。实验问题研磨：由于小麦芽比较长，且较多量的小麦芽接触液氮后相互间间隙很大，比较蓬松且脆，研磨时很容易使得小麦芽的磨碎物蹦出使得小麦芽损失。研磨时如果不能除净小麦芽上残留的水分，或者不在液氮的保护下进行实验会对实验结果造成什么影响？SS-苯酚问题：离心管不严，倾倒时苯酚会流出。由于苯酚的腐蚀性，虽然为了防范危险已经戴了手套，但是仍应该在实验时重点提出。第二次离心后的上层水相转入烧杯再转移入离心管比较复杂，能否合并为一步以减少复杂性RNase 处理步骤不做对实验的影响。蛋白质离心除去步骤不重复可能造成的影响。实验结果：成功制得了DNA样品。放入冷藏柜冷藏待用。实验计划：准备下一步的实验方法及改进，讨论实验中出现的问题。9.12实验情况实验目的：为验证实验的有效性以及探索更优的方法，对实验进行下一步的对照组DNA提取。采用标准方法进行测定，（保证小麦芽表面无水条件下进行实验，同时注意了部分研磨操作，提前预冷了研钵，其他试剂和操作与之前基本一致）实验结果：成功完成了对照组的DNA提取。熟悉了提取的操作步骤。9.13实验情况实验目的：完成对照组实验组的紫外分光测定。进行凝胶电泳。实验过程：在常志静学姐的指导下我们进行了第一次的凝胶电泳实验。虽然提前学习了学姐的指导，但是实验途中还是发现了许多问题。1 如何进样。2 如何计算进样量。3 如何设计合适的电泳时间保证最好的分离效果。紫外分光测定：第一次进行紫外测定发现DNA样液的数据超过了检出限，仪器显示“OVER”，在和老师的沟通下，发现了仪器上的问题还有比色皿的问题，使得问题得到了解决。紫外分光问题：DNA的稀释倍数不容易确定，差异很大，尤其是和小麦的量，DNA提取操作有很大关系。在和之前做的DNA样液对照试验发现：紫外对照结果：两组数据均超过正常值 A260/A280 小于1.8显示DNA中蛋白质含量比较高。琼脂糖凝胶电泳实验表明：研磨时不成粉状的（缺乏液氮保护的）一组颜色较浅（基本无颜色）另一组荧光稍可见。凝胶电泳实验总结： 虽然成功进行了电泳实验，但是效果不是很理想，DNA基本只在原点处没有发生条带移动。载样的大小还不能确定好。本次试验总体总结：实验验证了表面干燥的小麦芽分解相对较少，下次实验应该加以应用。由紫外数据发现RNA含量不多，解决了之前是否使用RNAse 以纯化DNA的问题。凝胶的制备和电泳操作已经基本清楚。但是是否是由于我们电泳载样量不足造成的荧光不明显我们并不清楚。下次实验目的：对已经验证的实验步骤进行标准化实验，重复试验以确定稳定性。再次进行凝胶电泳的电泳条件的探究。9.13实验情况实验目的：1对已经验证的实验步骤进行标准化实验，重复试验以确定稳定性。2再次进行凝胶电泳的电泳条件的探究。3为了实现我们对实验结果的可控性分析，我们引入了Marker作为标尺鉴定电泳结果。实验过程：本次实验注意到了之前总结的问题，包括小麦芽的处理，研磨时的液氮保护，防止溅出，实验的连续性，去掉了转移至烧杯中的步骤，直接在离心管中操作。实验的安全性苯酚使用前务必戴手套。凝胶电泳使用了标准的Marker标定进行测定。（gold view）实验结果：最后处理的DNA 进行琼脂糖电泳后显示Marker颜色也不是很深，证明是载样量问题造成的。也证明了我们的凝胶没有问题，电泳仪等设备和我们的电泳操作没有问题。但是我们自己的DNA跑得的结果仍不好，说明我们DNA提取还是存在问题的。9.14实验目的：一方面继续探索DNA提取实验，在途中进行录像工作。录像过程比较繁琐，途中多次NG，也有较多技术问题需要克服。1 清晰体现实验过程2 如何突出实验重点3 实验视频详细但是繁简有度，在讲述清楚的条件下尽量节省视频的时间。实验结果：录制了标准化的视频资料，没有进行完整的电泳实验。9.15情况没有进行实验，主要是完成了PPT制作以及演示视频制作9.16实验目的计算实验时需要使用的试剂的量，进行配液。完成之前的电泳实验。准备制作明天使用的凝胶。9.17 实验实验讲解过程：顺利的进行了对实验的原理的讲解（PPT）进行了实验操作流程的视频演示并辅以讲解。强调了本实验有毒物质（苯酚，sds，氯仿-异戊醇），以及标准操作。实验进行还算顺利。实验当时情况总结：实验中出现的主要问题：1紫外分光光度测定时DNA样品稀释倍数的确定。（需要根据每个人的实际情况不同区分，老师的建议是第一次不稀释，根据算出的浓度进行计算后在稀释相应的倍数）。2凝胶电泳时电泳载样量的确定。3凝胶不能被取出，不小心被弄破，使得实验被迫一度停止。4离心管在倒转时会发生渗漏，（造成苯酚漏出）。二实验结果：1、 高等植物DNA的提取和纯度鉴定组号组员小麦芽质量/g吸收度A260/A280吸收度比值原液浓度ug/mL点样浓度ug/mL1张慧、杨圆圆0.99720.675/0.5021.345168.7556.252齐蕊、任成凤1.1390.833/0.6901.207208.253陈丽、陈惠渝1.0010.303/0.2621.15675.754刘杨、吕程程1.39150.457/0.2721.68114.257.15贺巧巧、程旭东1.0470.496/0.4611.0761246张楠、周晨婷0.9400.253/0.2451.03263.2565.257夏超、徐子晨1.0000.503/0.4251.1850.38黄雄、李钰川0.9310.177/0.1171.51344.259王占薇、王振豪1.0570.276/0.2301.269 以上为部分实验组的数据，从数据可以看出，本次一班的高等植物DNA提取实验结果为：从吸收度比值看，因为A260/A2801.8时，表明蛋白质含量偏高；1.8 A260/A2802.0时，表明RNA或DNA碎片较多。以上9组的吸收度比值都小于1.8，说明所有组均是蛋白质含量偏高。从原液浓度看，浓度最高的是第2组，高达208.25ug/mL，而有5组的浓度都小于100ug/mL，这些组原液浓度低，说明部分组所提DNA量较少。从样液在260nm和280nm处的吸收度值可以看出，蛋白质浓度高的实验组相应DNA浓度也高，相差不大，有几组都接近于相等。说明样液中DNA和蛋白质几乎等量，蛋白质未除干净。2、琼脂糖凝胶电泳上面这张图是各组用所制备的样液稀释后，经琼脂糖凝胶电泳鉴定后的图。从图中可以看出，最右侧的Marker条带较清晰（由于照相的问题，所以条带较浅，实际情况很清晰），说明我们自己制备的凝胶没有问题。但由于我们在实验前没有做好充分的准备工作，因此没有最终确定点样浓度和上样量。从上面的表格可以看出有2组的点样浓度约为60ug/mL（由于有些组并没有记录点样浓度，因此无法知道其他组的点样浓度），上样量为5 uL经实验证明点样浓度较低，图片中间的点样浓度即为60ug/mL，无法显示出条带。而最左侧的2个条带点样浓度有所提高，点样量为10uL，可以显出条带，说明提取DNA成功，并且由于所提DNA较大，所以在凝胶电泳中前进的距离并不远。实验分析与讨论：为了改善实验结果，提高DNA的提取含量和尽可能除尽样液中的蛋白质，我们根据同学们的实验报告的分析情况和所查文献资料，进行一下实验条件的优化和创新，将从几个方面一一进行分析：所用材料及材料的预处理【实验方法】根据资料，在实际实验过程中，我们使用的材料是摘取长于1厘米的小麦芽约1克，吸干水分后，进行液氮研磨。【分析与改进方法】1、 确定理想的DNA提取材料在陈丽的实验报告中，她提到提取方法对不同的植物有不同的效应，这是因为在分离和纯化核酸时解聚核蛋白和去除蛋白质是很重要的一步，而不同的核酸结合的蛋白质的数量、成分、牢固程度有所不同，所以用不同的方法提取不同植物的DNA效果不一样。因此，要确定用什么植物来提取DNA效果最好。新鲜和幼嫩的植物材料因其含有较完整的DNA， 因而常成为制备高质量的基因组DNA的充分条件之一。对于大多数植物而言，健康的嫩叶是试验最佳的样本来源。因为健康的嫩叶不仅含有较少的代谢物，同时细胞数量也更多，而如果选择成熟或老化的叶片组织，多糖、多酚等代谢物相应增加，会给基因组DNA的提取带来困难，也会影响下面实验。而小麦幼芽由于细胞多数处于分裂期，所以含DNA量较高，而且小麦幼芽含蛋白质及其他代谢产物较少，所以我们可以确定小麦幼芽是作为提取DNA的材料较为理想。12、 材料的预处理对于这些材料通常用70%的乙醇清洗表面，并浸泡1min以去除外源的DNA污染，并用灭菌去离子水冲洗干净。3、 材料用量在提取液体积不变时,适当提高实验样品量是可提高目标产物的得率。这个从我们的实验数据也可以看出，一般小麦幼芽用量较多的，那么原液浓度就会相应较多。当然，这也会带来一个问题，就是蛋白质的含量可能也会偏高。研磨【实验方法】我们先用液氮将研钵预冷，然后放入干燥的小麦芽进行液氮研磨，保持研钵中有液氮存在。【分析与改进方法】1、 小麦幼芽的预冷冻在实验前，可以将小麦幼芽进行冷冻，有利于实验。例如，用液氮研磨前，先将小麦幼芽先冷冻干燥数小时，再进行研磨。2或者，可以将材料在4度冰箱中放置12天，有利于叶片中多糖类物质的降解，实验结果较好，DNA的OD260/OD280的比值在1.8 2.0 之间，说明DNA纯度较高。3 2、 研磨方法我们在实验过程中发现，用研钵研磨非常容易让小麦幼芽飞溅，使得材料损失。可以直接用锥型玻璃棒在15 mL 离心管中研磨，磨成糊状，这样避免了材料的损失。在小麦研磨过程中，关键是要快速，不能时间过长，磨细后要立即加抽提液，防止DNA的降解。这种方法不用液氮，操作简单、快速、经济、质量较好。4 水浴操作【实验方法】加入抽提液和SDS，用玻璃棒搅拌后放入65度恒温水浴，水浴30分钟。【分析及改进方法】水浴的目的是为了在温热条件下更好地使DNA与蛋白质分离，达到提纯的目的。为了达到好的水浴效果，可以采取一下措施：1、 采取两次水浴的方法5 第一次水浴（图1） 第二次水浴（图2） 在该方法中，采取两次重复的方式，图1为不同水浴时间第一次提取的DNA琼脂糖检测结果。图中，A、B:水浴90min左右提取的DNA; C、D:水浴30min左右提取的DNA; E、F:水浴60min左右提取的DNA; G、H:水浴120min左右提取的DNA; I:为水浴150min左右提取的DNA。从图1中可以看出90min和120min水浴时间所提的DNA泳带最亮,分布集中,无拖尾现象; 30min、60min所提的DNA带偏暗; 150min时DNA带有拖尾现象。图2为不同水浴时间提取DNA后残渣再次水浴90min,提取的DNA琼脂糖检测结果。A和B:水浴30min后再次提取获得的DNA; C和D:水浴60min再次提取获得的DNA; E和F:水浴90min左右再次提取的DNA; G和H: 120min 水浴后再次提取的DNA; I: 150min水浴后再次提取的DNA。从图2中可以观察出第一次水浴时间少于90min,第二次提取的DNA质量较好,第一次水浴时间超过120min, 第二次提取只能获得较少或者不能获得DNA。结合实验分析，第一次水浴在90min以下再次提取的DNA 质量较好,且没有明显的降解,水浴30min和60min后再次提取的DNA数量和质量明显比水浴90min以上的好。综合考虑,我们认为,第一次水浴时间以90min到120min为宜。另外，值得注意的是，如果材料较少，且非常珍贵，可以将第一次提取DNA后的残渣加入DNA提取缓冲液，第二次提取DNA。2、 水浴时的操作在水浴时不应用玻璃棒搅拌，而是直接混摇即可，以免机械力过大而使DNA断裂。可以采用如下实验条件：65度，水浴1h，中间每隔5-10min摇一次。4离心【实验方法】在实验中涉及到4次离心，前两次条件为4000r/min，8min，25度；后两次为4000r/min，10min，25度。【分析及改进方法】1、 离心转速的确定随着加入酚-氯仿和氯仿后提高转速,对DNA质量，和数量都有一定的影响。为了确定离心转速，从以下实验进行分析5上图为加入氯仿后不同离心转速提取的DNA琼脂糖检测结果。同样是重复两次，1、2: 加入酚-氯仿后离心的转速为10000 rpm; 3、4: 加入酚-氯仿后离心的转速为12 000rpm; 5、6:加入酚-氯仿后离心的转速为14000 rpm; 7、8:加入酚- 氯仿后离心的转速为16000 rpm从上图可以看出酚-氯仿后离心转速加大后,DNA带的变化不太明显,但是10 000 rpm的离心转速提取的DNA带亮度略强。所提取的DNA质量和数量逐渐减少,DNA降解明显。说明离心转速以10000rpm以下为宜，随着DNA提取进程的深入,离心转速要逐渐下降,这是获得高纯度DNA条件。2、 离心时间的确定随着提取的深入，离心时间应该逐渐减短，避免机械力对DNA的破坏，而我们实验中却是时间增长，这样不是很合理。3、 离心管渗漏问题在加入Tris饱和酚之后，许多组出现离心管倒转过程中易渗漏的问题，而Tris饱和酚有极强的腐蚀性，十分危险。张慧、杨圆圆组跟换一个离心管后即不漏。但是陈斌辉和陈志丹组跟换了3个离心管还是出现这个问题。建议可以在离心管关口外圈缠上生胶带，再盖盖子，并且在倒转过程中一定要带上手套。试剂用量与用法1、 增加试剂用量及次数：除蛋白质的步骤中,可适当增加氯仿/ 异戊醇的量和使用次数,直到DNA溶液和抽提有机溶剂界面上无白色沉淀（蛋白质）为止，这样有利于更加完全地去除蛋白质,从而提高产物的纯度。文献中的实验说明,通过连续三次氯仿/ 异戊醇来去除蛋白质，效果很好。尤其是样品较多时，增加氯仿/ 异戊醇的量更利于得到高质量的DNA.。6 2、减少试剂用量及次数95%乙醇是用于沉淀核酸，它的用量也会影响DNA的提取。贺巧巧在实验报告中提到，如果加入2倍体积95%乙醇，就有一种黄色干扰物7和DNA同时沉淀，而且在共沉淀时与DNA形成复合物，以后的纯化步骤很难将其与DNA分离。另外，这个复合物对以后的纯化步骤除去与DNA结合的组蛋白有一些影响，不利于DNA负超螺旋的解开，从而导致DNA样品中蛋白质不易除尽，导致吸光度结果是蛋白质含量过高。但其实用一倍体积时，绝大多数DNA已被沉淀，对DNA提取率无大影响。综合说明，只要用一倍体积95%乙醇沉淀核酸就可以。3、Tris饱和苯酚的加入时间8在水浴加热时，直接加入Tris饱和苯酚，这样可加强苯酚对蛋白质等杂质的变性能力。4、 用乙醇沉淀时，要沿离心管壁倒入，可以做到充分沉淀。5、 分别在水浴前和水浴后加KCl试剂对DNA提取的影响4上表为KCI对提取DNA质量的影响。从上表可以看出：水浴前加KCl 的OD260值均大于水浴后加KC1的值，说明水浴前加KC1提取的DNA含量高于水浴后，水浴后加KC1的OD280和OD320值小于水浴前加KC1的，且OD260OD280值均大于水浴前加KC1的，说明水浴后加KC1比水浴前加KC1的RNA含量和杂质含量低，DNA浓度和纯度相对较高。不加KC1的(材料1、2，对照)OD260值虽然较高，但OD280和OD 320值均高于水浴前和水浴后加KC1，且OD260OD280值均小于水浴前和水浴后加KC1，说明不加KC1比水浴前和水浴后加KC1提取的DNA 中含RNA和杂质多。综上说明，水浴后加KC1比水浴前加KCl及不加KC1的RNA 含量和杂质含量低，OD260/OD280比值大，DNA浓度和纯度有所提高。机械力及高温在整个提取过程中，机械力或高温会使DNA分子发生断裂。应尽量避免过多的溶液转移及剧烈震荡等，避免过高温度，操作时轻缓。程旭东猜测，大部分A260/A280比值较小的原因是在玻璃棒搅拌时，DNA都缠绕在玻璃棒上了，未用玻璃棒搅拌的组比值都在1.6左右。这与机械力有关。1、保持DNA长度的完整性的对策：（1）离心管倒转要轻柔，避免DNA断裂。（2）吸取DNA的枪头尖端应用刀削去，吸取用大口径的吸管。吸取时动作要轻柔。（3）如果要保存DNA提取液，应将DNA稀释液在4度保存，原液在-20度或-70度的冰箱保存，避免DNA的反复冻容。9 2、温度要求提取条件应尽量保持低温，因为当气温超过15度时，易引起DNA降解。在夏季高温时，可使用冰水浴。10 但是，值得注意的是，高温下苯酚对蛋白质等杂质的变性能力大大加强。因此，应注意找到合适的提取温度。3、干燥程度对DNA提取的影响11不同的干燥程度和方法对DNA的提取率也有影响。从上图中可看出,不论是玉米还是高羊茅草,用新鲜叶片提取的DNA,无任何降解,电泳呈现清晰而明亮的一条带(图1 - 1, 8) ;微波炉处理后DNA完全降解(图1 - 2, 9) ;室温下自然干燥的玉米DNA也降解,但草的DNA降解不严重(图1 - 3, 10) ;不同的烘干温度对DNA的影响作用是温度越高降解越严重, 45下烘干的DNA降解较少;硅胶干燥的叶片提取的DNA基本无降解,电泳条带清晰。综上可以看出，在45下烘干的新鲜叶片的DNA提取率最高。吸光度测定吸光度测定方式和条件不同也会影响到DNA的提取率。1、测量时的pHpH为7.4时，OD值最大，DNA提取率较高，偏离该值越远提取率越低（具体可见下表）12，因此在实验改进的过程中，可以通过用pH试纸跟踪测试不同时期溶剂的pH值，而本次实验中所选用的TE缓冲液pH为8.0，可以适当降低pH。 2、 测定时间测定时间的不同也会影响到DNA的提取率。王占薇报告中提到，测试DNA吸光度时，应该在DNA配制后内测试，灵敏度较高。（目前仍待考证，还未找到相关文献） DNA提取方法的比较与总结13迄今为止国内外报道的植物DNA提取方法多达好几十种。1、 采用CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）代替SDS，CTAB法能很好地去除糖类物质，对于含糖较高的材料可优先采用。 但由于步骤多、试剂组成复杂、易污染等缺点，在使用上受到了一定的限制。DNA纯度高，色泽纯白。 2、采用基因释放剂提取DNA，省略了复杂的提取步骤，对某些难得的样品组织标本等微量即可使用。 3、用试剂盒，包含了提取植物DNA所需试剂，能直接用于提取高质量DNA，无需酚、氯仿和SDS等，操作简单、快捷，所得DNA浓度高。 4、NaOH法，用时短，简单，但提纯的DNA纯度不高。6、 其他方法：如高盐pH法，简易操作方法，碱裂解法，脲法，S法，苯酚法。凝胶电泳之前已经描述过我们实验的DNA凝胶电泳结果，可以发现DNA条带出现了DNA条带模糊、条带弱或无带的现象。从下图中，我们就可以分析出出现这些情况的原因以及相应的解决办法。另外，其他一些因素也会影响DNA凝胶电泳的结果。1、重制凝胶我们在实验过程中只做了2块胶，有一块胶在拔胶的过程中损坏，因此必须重熔再制备。但随着融化次数的增加，水分丢失也越多，凝胶浓度会越来越高，导致实验结果不稳定。应该在重制胶时进行补水：是在容器上标记煮胶前的刻度，煮胶后补充水分到原刻度；是在煮胶前称重，煮胶后补充水至原重量。粗略一点的办法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值，以保证凝胶浓度基本维持在原浓度。2、 拔梳板的方法和时间点样孔的破坏与拔梳板的时间和方法有关，一般凝胶需冷却30min以上方可拔出梳板，应急的情况下可以将成型的凝胶块放入2度冰箱冷却15min左右。拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中，然后垂直向上慢慢