植物解剖与制片技术.doc

植物解剖与制片技术 石蜡切片法一、实验目的通过对材料的固定、脱水透明、浸蜡、包埋、切片等实验操作，了解石蜡切片的基本过程，掌握石蜡切片的制作方法。二、实验原理石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法，它是组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。石蜡切片的优点：比较省时间、易操作，可切成极薄的切片，能制作连续切片，组织块可包埋在石蜡中永久保存；缺点是只能用于较小组织块，较大组织块不易切好，容易破碎，组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆，制片时间太长。三、实验试剂、材料与工具（一）试剂：蒸馏水、酒精（alcohol缩写AL）、番红、FAA固定液、固绿、二甲苯、石蜡、1%明胶、封藏树胶等。（二）材料：2011年9月21日于蔬菜所采集的新鲜的油莎豆的叶片与根。（三）工具与仪器：解剖刀、镊子、三脚架、酒精灯、火柴、纸盒、载玻片、盖玻片，染缸；切片机、烘箱、展片机等。四、实验方法与步骤步骤一：取材固定脱水（70%酒精80%酒精95%酒精100%酒精100%酒精，每步2-4小时）透明（12二甲苯+12酒精，2小时；二甲苯）低温渗蜡（12二甲苯+12蜡，40，过夜）。步骤二：低温渗蜡高温渗蜡（58，纯蜡，每隔2小时换蜡一次，不超过6小时）包埋（一个蜡船放34个材料）。步骤三：修块切片粘片展片烘片。步骤四：脱蜡与染色：二甲苯（30分钟）二甲苯（10分钟）复水（12二甲苯+12酒精100%酒精85%酒精；每步10分钟）染色（70%配制的番红，过夜）。步骤五：番红85%酒精5分钟染色（95%的酒精配制的固绿染液，1分钟）95%酒精100%酒精100%酒精二甲苯二甲苯（每步5分钟）封片（标记）烘烤。五、观察与照相油莎豆为单子叶植物，在根部分蘖，所以没有茎，取其叶片，根部叶片，根做石蜡切片结果如下：(1) 叶片：图上部叶横剖面图图上部叶叶脉维管束图图 基部叶横剖面图图 基部叶维管束图（2）根：图 根横剖面图图 根中柱鞘横剖面图六、结果分析与讨论1、叶片：表皮 细胞一层，排列紧密，表皮中应用成对的保卫细胞和副卫细胞。叶肉 无栅栏组织和海绵组织之分，细胞比较均一，但从图看出上部叶肉组织细胞大且排列紧密，下部叶肉组织排列较疏松，且细胞富含叶绿体；但基部叶由于包在土中颜色为白色，如图，上下部叶肉组织差别不大，细胞中叶绿素较少。叶脉 为典型的单子叶植物有限维管束（图、图），且木质部位于近轴面，韧皮部位于远轴面。维管束外有两层维管束鞘，外层细胞较大，壁薄，含有叶绿体；内层细胞小，壁厚。维管束的上下两侧具有厚壁细胞，一直延伸到表皮下，厚壁细胞对维管束具有支持作用。而且上部叶与基本叶相比，含有大量的维管束，在上部叶肉细胞中叶脉分大、中、小三部分而且排列紧密；基部叶只有主脉和次脉之分，排列疏松。上部叶中机械组织远比基部叶发达。2、根：采集材料时，油莎豆已属于成熟期，所以根为老根，根毛已基本脱落。表皮 根的最外层细胞，排列整齐，多已枯萎，根毛已脱落。皮层 外皮层细胞一层，细胞小，排列整齐。由于根为老根，外皮层细胞壁增厚，部分已木质化。内皮层细胞有凯氏带加厚，对着初生木质部的内皮层细胞为通道细胞。维管柱 由中柱鞘、木质部和韧皮部组成。中柱鞘紧贴内皮层，图和图中显示中柱鞘已被染成红色，说明在老根中中柱鞘已全部木质化。木质部与韧皮部相间排列，木质部脊数较多，为多原型。维管柱中央为薄壁细胞组成的髓。七、注意事项1. 取材。根据观察研究的目的不同，选取合适的材料。用锋利的刀片截取需要的材料固定，根、茎长度为3-5 cm，叶片应过主脉。一定要详细记录：日期、采集地点、标本名称、取材部位、固定液种类。2. 固定。用适当的化学药液固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。固定能使组织硬化，有利于切片的进行，而且也有媒浸作用，有利于组织着色。固定液的用量通常为材料块的20倍左右，固定时间则根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以从1小时至数天，通常为数小时至24小时。本实验用FAA固定液固定24小时。固定液也是良好的保存液。3. 脱水。固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。固定后或洗涤后的组织内充满水分，如不除去水分就无法进行以后的透明、浸蜡与包埋，因为透明剂多数是苯类，苯类和石蜡均不能与水相融合，水分不脱尽，苯类不能浸入。酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30或50酒精开始，经70、85、95直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1数小时，如不能及时进行各级脱水，材料可以放在70酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化，不宜处理过久。本实验所以的固定液由70%的酒精配制的，所以脱水从70%的酒精开始。4. 透明。纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明。常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各种透明剂均是石蜡的溶剂。通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍12小时，再转入纯透明剂中浸渍。透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小及属于囊腔抑或实质器官而定。如果透明时间过短，则透明不彻底，石蜡难于浸入组织；透明时间过长，则组织硬化变脆，就不易切出完整切片，最长为数小时。5. 浸蜡与包埋。用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍12小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中（摆好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀。通常石蜡采用熔点为5658或6062两种，可根据季节及操作环境温度来选用。注意包埋时将最好将材料立起，以使切片时能较好的切到所要观察的组织。并要防止进入气泡。6. 修块与切片。包埋好的蜡块用刀片修成规整的方形或长方形，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为47微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。7. 粘片与展片。用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后的脱蜡、水化及染色等步骤中二者滑脱开。在载玻片上滴两滴蒸馏水，再滴一滴粘片剂，再把蜡片放于水滴上，最后用滤纸吸除多余水分，略加温使蜡片铺展，将载玻片放入烘箱中干燥， 8.脱蜡与复水。干燥后的切片需脱蜡及水化才能在水溶性染液中进行染色。用二甲苯脱蜡，再逐级经纯酒精及梯度酒精直至蒸馏水。如果染料配制于酒精中，则将切片移至与酒精近似浓度时，即可染色。9.染色与脱水。倒入番红染液染色，时间为12-24小时。然后经85%酒精、95%酒精脱水冲洗，每级5min。固绿复染1min。用95%酒精和100%酒精两次彻底脱水，每级5min。染色的目的是使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色以便于观察。10.透明与封固。用1/2酒精+1/2二甲苯混合液处理5