水检测底物酶法测生活饮用水大肠菌群.doc

摘要：由于传统方法在检测水中大肠菌群和大肠埃希氏菌需要48小时左右,且操作过程复杂,难以掌握。现介绍一种快速简便的检测方法，根据生活饮用水国家卫生标准（GB/T 5750-2006）中推荐的固定底物技术酶底物法可购买到市售化产品IDEXX公司的Colilert试剂1。用于检测100ml水样，只需手工操作2分钟，即可在24小时内同时定量检测出大肠菌群和大肠埃希氏菌。此方法大大的减少了工作量，避免了使用多管法的逐级稀释带来的操作误差；也避免了使用滤膜法时肉眼读数的人为误差，所以其假阳性率和假阴性率都比传统方法低。由于24小时内就得到结果，可以很好的用于突发事件应急。 关键词：大肠菌群 大肠埃希氏菌 固定底物技术酶底物法 Colilert试剂1. 背景：目前我国对生活饮用水、水源水、地表水等进行卫生学评价，检测的指标为大肠菌群和大肠埃希氏菌或粪大肠菌群（耐热大肠菌群），以这些指标作为粪便污染的指示菌。采用的标准检测方法为膜过滤法和多管发酵法。但这两种方法检测时间相对较长，需4872小时，需验证试验，试验步骤较为繁琐，所以不能对水的卫生学状况做出快速评价。因此，采用快速简便的检测方法十分必要。固定地物技术酶底物法可以较好的弥补传统方法的不足。2. 原理1：固定底物技术酶底物法（Defined Substrate Technology）采用大肠菌群细菌能产生-半乳糖苷酶（-D-galactosidase）分解ONPG（Ortho-nitrophenyl-D-galactopyranoside）使培养液呈黄色，以及大肠埃希氏菌产生-葡萄糖醛酸酶（-glucuronidase）分解MUG（4-methyl-umbelliferyl-D-glucuronide）使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光的原理，来判断水样中是否含有大肠菌群及大肠埃希氏菌。固定底物技术酶底物法可以选用国标中推荐粉状培养基（IDEXX公司的Coiliert试剂）来进行简便的操作；无需确认试验；固定底物技术酶底物法检测时间短，只需24小时即可同时定量出水样中大肠菌群和大肠埃希氏菌的MPN值。3. 试剂和设备：3.1试剂：采用固定底物技术酶底物法市售化的MMO-MUG（Minimum Media ONPG-MUG）培养基Colilert试剂1。3.2耗材：取样瓶或使用灭菌的玻璃；51孔定量盘或97孔定量盘；注：51孔定量盘可在无需稀释的情况下检测1200个目标菌/100ml水样；97孔定量盘可在无需稀释的情况下检测12419个目标菌/100ml水样。3.3设备：定量程控封口机；366nm紫外灯；阳性对照物注：定量程控封口机除了将定量盘进行封口外还对100ml水样平均分配到51个孔或者是97个孔中。4. 操作方法：4.1定性检测：4.1.1适用范围：一般用于检测饮用水、瓶装水等；这些水样的结果是不得检出。所以只需用定性检测就可满足试验要求。4.1.2操作步骤：1)将一个Colilert试剂倒入装有100ml水样的无菌取样瓶或无菌玻璃瓶中，混匀。2)放在361培养箱，培养24小时；注：如检测耐热大肠菌群（粪大肠菌群）则需放在44.5，培养24小时；如果培养时间超过28小时，则阴性结果则结果有效，如果为阳性结果则结果无效，需重做此水样。3)根据下面的结果解释读取结果4)无需确认试验4.2定量检测4.2.1适用范围：适用于任何一种水体。4.2.2操作步骤：1)将一个Colilert试剂倒入装有100ml水样的无菌取样瓶或无菌玻璃瓶中，混匀。（如图1）2)将瓶内的水样全部倒入51孔或者是97孔定量盘中，以手抚平定量盘背面以赶除孔穴内气泡，然后使用定量程控封口机进行封口。3)将定量盘放在361培养箱，培养24小时注：如检测耐热大肠菌群（粪大肠菌群）则需放在44.5，培养24小时；如果培养时间超过28小时，则阴性结果则结果有效，如果为阳性结果则结果无效，需重做此水样。4)根据下面的结果解释读取结果。数出阳性格子数后对照MPN表得到结果。5)无需确认试验5. 测量范围5.1 最低检出限Colilert试剂可以在24小时同时检测出总大肠菌群和大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群（粪大肠菌群），它可以在100ml水样中抑制2百万个杂菌干扰，最低检出限为每100ml水样可检测出1cfu的总大肠菌群，大肠埃希氏菌，耐热大肠菌群（粪大肠菌群）。5.2 选用51孔定量盘在不稀释的情况下，100ml水样可检测200个总大肠菌群，大肠埃希氏菌，耐热大肠菌群（粪大肠菌群）。5.3选用97孔定量盘在不稀释的情况下，100ml水样可检测2419个总大肠菌群，大肠埃希氏菌，耐热大肠菌群（粪大肠菌群）。6 检测水样的范围l饮用水l源水l瓶装水l中水l二次供水l管网水l废水l食品水l畜牧用水l医疗用水7实验过程中需注意的地方l如果样品有背景颜色，请做一个空白实验，与结果相比较l如果样品被稀释，则在读取MPN表时乘以相应的稀释倍数l只可使用纯水，不含缓冲液的水，不含氧化剂的水进行样品稀释l如果样品中含有过多的氯，则在加入Colilert时会显蓝光，此时样品应被终止检测8结论总大肠菌群细菌主要由以下4个菌属细菌组成：埃希氏菌属、柠檬酸菌属、克雷伯菌属和肠杆菌属。这些菌属可以在人、畜粪便中检出，有的也可以在营养丰富的水体中检出，即在非粪便污染的情况下，也有检出这些细菌的可能性。粪大肠菌群组成与总大肠菌群组成相同，但主要组成是埃希菌属，在此菌属中与人类生活密切相关的仅有一个种，即大肠埃希氏菌；柠檬酸菌属、克雷伯菌属和肠杆菌属所占数量较少。作为粪便污染的指示菌，大肠埃希氏菌检出的意义最大，其次是粪大肠菌群，总大肠菌群的检出意义略差一些2。固定底物技术酶底物法操作简便，