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345 专题论述食品科学2011 Vol 32 No 13 烹调肉制品中杂环胺的检测技术和控制手段 研究进展 吕 美 曾茂茂 陈 洁 食品科学与技术国家重点实验室 江南大学食品学院 江苏 无锡 214122 摘 要 杂环胺是烹调肉和鱼等高蛋白食物过程中形成的一类致癌致突变化合物 本文概述烹调肉制品中杂环胺的 前处理方法和检测技术 并重点阐述肉制品加工过程中产生杂环胺的控制手段 关键词 杂环胺 烹调食品 检测技术 控制手段 Research Progress of Detection Technologies and Control Measures for Heterocyclic Amines in Cooked Meat LU Mei ZENG Mao mao CHEN Jie State Key Laboratory of Food Science and Technology School of Food Science and Technology Jiangnan University Wuxi 214122 China Abstract Heterocyclic amines HAs are mutagenic and carcinogenic compounds formed in high protein foods such as meat and fish during cooking Current sample pretreatment technologies and detection methods for HAs in cooked meats are summarized and the stress is put on introducing approaches for controlling their formation in the processing of meat products Key words heterocyclic amines cooked foods detection technology control measures 中图分类号 TS251 1 文献标识码 A 文章编号 1002 6630 2011 13 0345 05 收稿日期 2010 09 25 基金项目 国家自然科学基金项目 20976071 31000751 江苏省自然科学基金项目 BK2009614 国家星火计划项目 2008GA690137 作者简介 吕美 1986 女 硕士研究生 研究方向为食品蛋白质功能 E mail lumei2010 通信作者 陈洁 1969 女 教授 博士 研究方向为食品蛋白质功能 E mail chenjie 饮食习惯是诱发癌症的重要因素之一 人们的日常 饮食中有许多致癌物质 如苯并芘 N 亚硝基化合物 多环芳烃和杂环胺等 杂环胺 heterocyclic amines HAs 是烹调富含蛋白质的食物过程中蛋白质或氨基酸热 解产生的一类具有致癌致突变作用的多环芳香族化合 物 1977 年 日本科学家首次在烤鱼和烤牛肉制品中 发现杂环胺 1 到目前为止 从高温烹调肉制品中分离 和鉴定出的杂环胺已近30种 国际癌症研究中心 IRAC 将2 氨基 3 4 二甲基咪唑 4 5 f 喹啉 MeIQ 2 氨基 3 8 二甲基咪唑 4 5 f 喹啉 8 MeIQx 2 氨基 1 甲基 6 苯 基咪唑 4 5 b 吡啶 PhIP 2 氨基 9H 吡啶 2 3 b 吲哚 A C 2 氨基 3 甲基 9H 吡啶 2 3 b 吲哚 MeA C 3 氨基 1 4 二甲基 5H 吡啶 4 3 b 吲哚 Trp P 1 3 氨 基 1 甲基 5H 吡啶 4 3 b 吲哚 Trp P 2 以及2 氨基 6 甲 基二吡啶 1 2 a 3 2 d 咪唑归类为可疑致癌物 2B级 而 2 氨基 3 甲基咪唑 4 5 f 喹啉 IQ 为潜在致癌物 2A 级 并且建议减少这些化合物的暴露量 2 过去 30 年间 国外研究人员对杂环胺进行了广泛 的研究 概括起来主要分为以下四个方面 第一 肉 制品中杂环胺的分离富集和定性定量分析 3 4 第二 杂环胺形成的影响因素和控制手段 5 第三 杂环胺形 成的反应机制 6 和抑制剂对杂环胺的抑制机理 7 第四 杂环胺的体内致癌 致突变机制 8 和抑制剂在体内对杂 环胺所引发的致突变性和致癌性的抑制效果和机理 9 本文将简要介绍烹调肉制品中杂环胺的分离富集和检测 技术 并着重分析肉制品加工过程中生成杂环胺的控制 途 径 1烹调肉制品中杂环胺的分离富集与检测技术 由于杂环胺在烹调肉制品中仅以痕量水平存在 并且烹调后肉制品的组分相当复杂 因此采用高效 的分离富集和灵敏的检测方法 对于分析肉制品中 2011 Vol 32 No 13食品科学 专题论述346 杂环胺的含量至关重要 1 1肉制品中杂环胺的分离富集方法 一般在检测肉制品中的杂环胺之前 需首先对样品 中的杂环胺类物质进行分离富集 主要包括沉淀蛋白 去除脂肪以及通过液液萃取 固相萃取 超临界流体 萃取和蓝棉等一系列分离富集步骤 由 Gross 等 10 提出 的固相支持下进行液液萃取而后再用阳离子交换和C18固 相萃取的方法 近几年来几乎成为分析杂环胺的标准前 处理方法 图 1 描述了该方法的简要流程 其他的方法 均是在 Gross 等 10 的方法上进行改进 但基本的原理和 方法不变 经典的样品前处理方法可概括为 第 1 步 沉淀蛋白 采用氢氧化钠溶液溶解 均质样品 并通 过离心或过滤去除蛋白质 第 2 步 液液萃取与使用吸 附剂萃取结合使用 通过连续的酸碱分配过程来实现 通常使用硅藻土作为吸附剂 水相以薄层的形式在化学 惰性基质上分散 用二氯甲烷将杂环胺洗脱下来 同 时在二氯甲烷中加入少量甲苯会改善提取效率 第 3 步 两个固相萃取过程 使用强阳离子柱包括丙基磺 酸柱 PRS 以及反相 C18柱来实现 3 最后 通过氮气吹 干浓缩 是定性定量分析食品中杂环胺的常规方法 通过比较样 品与标样的二极管阵列检测器产生的特征紫外吸收光谱 可对样品中的杂环胺类物质进行定性 对于可以产生荧 光信号的杂环胺类化合物的检测通常同时使用荧光检测 器与紫外检测器进行定量 11 然而 由于肉制品经预处 理后仍有大量共提物 而被测物杂环胺的浓度非常低 色谱峰干扰较大 同时一些干扰物的紫外吸收光谱图与 被测物比较接近 因此 HPLC UV 法通常难以进行准确 的定性定量分析 近年来迅速发展的串联质谱 MS 技术 主要包括 气相色谱串联质谱 GC MS 和高效液相色谱串联质谱 LC MS 应用于复杂肉制品中杂环胺的检测 具有其 他方法不可比拟的优势 LC MS 很好地结合了色谱良好 的分离能力和质谱的高灵敏度和高选择性 并且通过高 效液相色谱串联二级质谱 LC MS MS 可以达到更佳的选 择性 LC MS和LC MS MS是目前检测肉制品中杂环胺 的最佳方法 12 气相色谱法 GC 和气相色谱串联质谱 GC MS 也可用于杂环胺的检测 但是由于大部分杂环 胺极性较大且难挥发 只有少数杂环胺经衍生化后可采 用 GC 或 GC MS 检测 但应用并不广泛 3 随着超高效液相色谱 UPLC 这种强有力的分离技术 的发展 超高效液相色谱串联二级质谱 UPLC MS MS 也被应用于杂环胺的检测 UPLC借助于传统的HPLC的 理论和方法 通过采用 1 2 m 的细粒径填料和细内径 色谱柱而获得很高的柱效 UPLC 可以大幅度改善色谱 分离度 同时还大大缩减了色谱分析时间 如 Barcelo Barrachina 等 13 采用超高效液相色谱 电喷雾串联二级 质谱 UPLC ESI MS MS 技术分析复杂食品体系中的杂 环胺含量 仅在2min 内就完成了 16 种杂环胺的分离和 分 析 2肉制品加工过程中杂环胺产生的控制手段 目前从烹调肉制品中 分离和鉴定出的杂环胺已近 30 种 由于杂环胺具有强烈的致癌性和致突变性 如 何控制肉制品加工过程中杂环胺的产生是研究人员迫切 需要解决的问题 影响杂环胺产生的最主要因素是烹调 方式 包括烹调方法 温度 时间等 采用合理的烹 调方式可以有效地抑制杂环胺的产生 另外 合理添 加一些合成或天然抗氧化剂也可有效地抑制杂环胺的产 生 然而 人工合成抗氧化剂如丁基羟基茴香醚 BHA 和二丁基羟基甲苯 BHT 等都具有一定的潜在毒性 14 所以天然抗氧化剂和天然植物组织等成为了替代人工合 成抗氧化剂以控制杂环胺产生的理想选择 关于抗氧化 剂抑制杂环胺生成的反应机理 大多数研究人员普遍认 为与抗氧化剂清除 Maillard 反应中间产物的不稳定自由 1 2肉制品中杂环胺的检测方法 过去 30 年 高效液相色谱 紫外法 HPLC UV 无疑 图 1 样品中杂环胺的分离富集方法 Fig 1 Separation and enrichment procedures of heterocyclic amines in samples PRS柱的干燥 抽真空法 6mL 0 1mol L HCl 15mL MeOH与0 1mol L HCl 体积比3 2 2mL H2O 第1 次洗脱 0 5mL NH3中和 H2O稀释MeOH含量低于20 2mL H2O 洗涤 干燥C18柱 抽真空法 1 4mL MeOH与NH3 体积比9 1 溶液洗脱 20mL 0 5mol L CH3COONH4 pH8 5 洗脱 2mL H2O 洗涤 干燥C18柱 抽真空法 0 8mL MeOH与NH3溶液 V V 9 1 洗脱 第2 次洗脱 样品制备 3 4g肉样与10mL 1mol L的NaOH溶液超声振荡1h 提取 13g硅藻土与75mL 含体积分数5 甲苯的二氯甲烷混合 纯化 500mg的PRS 柱 净化 500mg的C18柱 PhIP Trp P 1 Trp P 2 Harman Norharman A C Me A C Glu P 1 非极性部分提取液 浓缩 N2吹干 C18柱 500mg IQ MeIQ MeIQx 4 8 DiMeIQx极性部分 提取液浓缩 N2吹干 347 专题论述食品科学2011 Vol 32 No 13 基有关 15 然而 最新研究表明表没食子儿茶素没食子 酸酯 EGCG 抑制PhIP生成的机制与EGCG清除自由基无 关 而是由于EGCG 与苯丙氨酸经 Strecker 降解产生的 中间体苯乙醛形成了一系列稳定的加合物 从而阻断了 苯乙醛进一步与肌苷酸反应生成 PhIP 16 2 1采用合理的烹调方式 油煎 油炸和烧烤等直接与火接触或与灼热的金属 表面接触的高温烹调方法 产生的杂环胺含量最大 其 次是焙烤和烘焙等间接传热和较低温度的烹调方式 产 生中等含量的杂环胺 炖 焖 煨 煮等低温 低于 100 且水分较多的烹调方式几乎没有杂环胺产生 17 在烹调肉 鱼制品中 应避免采用与火焰直接接触的 烹调方式 并控制好加热的时间 这样可以有效地控 制杂环胺的生成 另外 生肉在进行煎炸之前 进行 适当的微波处理也可以大幅减少杂环胺的生成量 研究 表明经过 3min 微波前处理后 尽管杂环胺生成的前体物 质 肌酸 肌酸酐 氨基酸和糖 水分和脂肪只减少 了 3 0 但煎炸后肉制品中杂环胺的生成量减少了 90 95 18 2 2添加人工合成的抗氧化剂 人工合成的抗氧化剂包括 BHA BHT 没食子酸 丙酯 PG 和叔丁基对苯二酚 TBHQ 等 对于杂环胺生成 的抑制效果取决于抗氧化剂的种类 添加量和食品体系 等因素 Chen 19 的研究发现在煎碎牛肉饼中添加100 g g 的 BHA PG 和 TBHQ 可以减少杂环胺的生成量 另有 研究表明 BHT 在真实的食品体系中有抑制杂环胺生成 的效果 但是并不显著 20 而 Tai 等 21 的研究发现在鱼 肉纤维中添加 BHT 后 BHT 对杂环胺的抑制效果取决 于 BHT 的添加量 当添加低浓度的 BHT 时会显著促进 杂环胺的生成 只有添加高浓度的 BHT 时 才可有效 地抑制杂环胺的生成 2 3添加天然抗氧化剂 天然抗氧化剂主要包括维生素 类胡萝卜素和酚 类化合物这三大类 在炒猪肉松之前添加不同浓度的 VC 和VE 结果表明添加0 1g 100g的VE可以减少猪肉 松中 Norharman PhIP A C 和 MeA C 的生成量 然而无论是添加何种浓度的VC都不能有效地抑制杂环胺 的生成 22 Oguri 等 23 分别在包含肌酸酐 葡萄糖和甘氨酸与 包含肌酸酐 葡萄糖和L 苯丙氨酸的模型体系中考察了 14 种酚类化合物分别对 MeIQx 和PhIP 形成的影响 结 果表明绿茶儿茶素 EGCG 毛地黄黄酮 槲皮素和咖 啡酸能显著地抑制杂环胺的生成 Cheng 等 7 分别采用 包含肌酸 葡萄糖和苯丙氨酸的产生PhIP 的模型体系与 煎碎牛肉饼体系来探讨酚类物质对杂环胺形成的影响 结果证实 在模型体系中茶多酚包括 EGCG 3 3 二没 食子酸酯茶黄素 表儿茶素没食子酸酯 ECG 和表没食 子儿茶素 EGC 都可以有效地抑制杂环胺的生成 同样 黄酮类包括柚皮苷 异槲皮素 橘皮苷也可以显著抑 制杂环胺的生成 相反 酚酸类包括迷迭香酸 鼠尾 草酸和绿原酸都强烈地促进了PhIP 的形成 而在煎碎牛 肉饼中 酚类物质对PhIP 4 8 DiMeIQx和MeIQx这3种 杂环胺的抑制效果按递减顺序为 柚皮苷 3 3 二没食 子酸酯茶黄素 迷迭香酸 ECG 鼠尾草酸 2 4添加植物提取物或植物组织 近年来 有大量研究表明在烧烤肉制品中加入具有 抗氧化性的香辛料提取物可以有效地抑制杂环胺的生 成 例如 Oz 等 24 报道在加热高脂肉丸子前添加黑胡 椒 对PhIP 的抑制率达到了100 并且在不同的加热 温度下黑胡椒将杂环胺的总量减少 12 到 100 不等 Janoszka 25 的研究表明在猪肉中加入相当于猪肉质量30 的洋葱 使猪肉和肉汁中杂环胺的总量减少31 到 49 左右 在猪肉中加入相当于猪肉质量 15 的大蒜 使 猪肉和肉汁中杂环胺的总量减少 2 6 到 3 6 左右 Puangsombat等 26 将5 种不同提取条件的迷迭香提取物加 入到牛肉饼后再烹调 结果表明不同提取条件的迷迭香 对杂环胺的生成均有不同程度的抑制作用 尤以迷迭香 乙醇提取物的效果最为显著 分析认为该提取物中迷迭 香酸 卡诺醇和鼠尾草酸起到了协同抑制作用 另外 Cheng 等 5 在煎碎牛肉饼中添加了苹果 接骨木 葡萄 籽和菠萝的提取物 来探讨水果提取物对杂环胺生成的 抑制作用 结果表明苹果和葡萄籽提取物最有效地抑制 了MeIQx 4 8 DiMeIQx 和 PhIP 这3 种杂环胺的生成 并且使杂环胺的总量降低了70 并进一步证实水果中 的原花青素 根皮苷和绿原酸是抑制杂环胺的主要活性 成分 Ahn 等 27 发现松树皮提取物和葡萄籽提取物对极 性杂环胺 如IQ MeIQ MeIQx DiMeIQx 和 PhIP 和 非极性杂环胺 A C Norharman 和Harman 都有抑制作 用 高纯度的绿茶多酚提取物Polyphenon B 和高纯度 的红茶多酚提取物 Polyphenon 60 在煎碎牛肉饼中可以 有效抑制杂环胺的生成 抑制率与茶多酚提取物的浓度 有关 28 在高温烹调肉之前加入大豆蛋白 也被证实 了可以减少IQx 和MeIQx 的生成量 29 2 5烹调肉制品前腌泡 已有大量研究证实 在烹调肉制品前进行腌制可以 有效抑制杂环胺的生成 一项最新研究表明 煎碎牛 肉饼前以玫瑰茄提取物 hibiscus sabdariffa 葵花油乳状液 进行腌泡后可以抑制 MeIQx PhIP Norharman 和 Harman 的形成 并且感官评定结果表明腌泡组和对照 组在风味上没有显著性差异 30 Quelhas 等 31 将碎牛肉 OR OR 2011 Vol 32 No 13食品科学 专题论述348 用绿茶腌泡后煎炸 PhIP 和 A C 的生成量显著降低 但是 4 8 DiMeIQx和MeIQx的生成量并没有降低 在煎 碎牛肉饼前用洋葱 大蒜和柠檬汁的葵花油或 和轻榨 优质橄榄油腌泡 也可以起到抑制效果 并且洋葱 大蒜和柠檬汁腌泡的最佳浓度分别为 31 2 28 6 和 14 6 而在有些浓度下洋葱和柠檬汁的实验组相反会 轻微地促进非极性杂环胺的生成 32 Busquets 等 33 在煎 鸡胸脯肉前用3种红酒腌泡 结果表明用3种红酒对PhIP 的形成均有抑制作用 在腌泡时间为24h 时抑制率高达 88 相反 3 种红酒都极大地促进了 Harman 的形成 而 3 种红酒在不同的腌泡时间下对MeIQ 4 8 DiMeIQx 和 Norharman 的形成的影响规律不明显 Melo等 34 的研 究表明将牛肉用啤酒和红酒腌泡后再烹调 对 PhIP MeIQx 和 A C 均有抑制作用 3结 语 目前国外在肉制品中杂环胺的检测 生成机理和控 制手段等方面已进行了大量的研究 但国内对于传统肉 制品中杂环胺的分析以及控制则罕见报道 35 然而煎炸 烘烤肉制品又是一种深受国人喜爱的食品 因此 加 强杂环胺检测技术的研究 并结合我国自身特点发展杂 环胺的控制方法 降低其在我国传统肉制品中的含量是 食品科研人员迫切需要解决的难题 参 考 文 献 1 SUGIMURA T NAGAO M KAWACHI T et al Mutagen carcinogens in foods with special reference to highly mutagenic pyrolytic products in broiled foods M HIATT H H WASTON J D WINSTEN J A Origins of human cancer New York Cold Spring Harbor 1977 1561 1577 2 WHO IARC IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans Vol 56 Some naturally occurring substances food items and constituents heterocyclic aromatic amines and mycotoxins M World Health Organization 1993 3 ALAEJOS M S AYALA J H GONZALEZ V et al Analytical methods applied to the determination of heterocyclic aromatic amines in foods J Journal of Chromatography B 2008 862 1 2 15 42 4 MURKOVIC M Analysis of heterocyclic aromatic amines J 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