水稻白叶枯病抗性基因Xa23的分子标记优化及应用.doc

水稻白叶枯病抗性基因Xa23的分子标记优化及应用摘要：结合生物信息学的方法，对水稻白叶枯病（ o，）抗性基因的标记进行了改良和优化，获得了测序品种日本晴中电子克隆的序列，设计改良的分子标记，命名为。用扩增个水稻亲本和份中国栽培稻微核心种质材料，研究了该分子标记的稳定性和特异性。标记多态性检测结果表明，在阳性亲本中扩增出大约 的条带，其他个常用水稻亲本中都是扩增出约 的条带；中国栽培稻微核心种质中个品种扩增出约 的单一条带，个品种扩增出约 的单一条带。利用对含基因的个代育种家系进行了分子标记辅助选择，获得了个纯合的抗性株系。这些结果证明标记具有特异性强，共显性，扩增产物差异大，利用的琼脂糖凝胶电泳即可快速分清等位差异的特点，能广泛用于抗病基因的辅助选择；该研究中采用的生物信息学的方法对其他基因分子标记的设计或改良也具有一定的借鉴和指导意义。关键词：水稻；白叶枯病（ o，）；分子标记辅助选择；生物信息学 ， ， ， ， ， ， ， ， （ ， ， ，； ， ，）： ， ， ， ， ； w ， ， ， ， ： ； （ o，）； ； 水稻是我国和世界上最重要的粮食作物之一。近年来我国水稻播种面积为 万 万。白叶枯病（ ，）是目前世界水稻生产中的三大病害之一，一般病田减产，重病田损失可达，甚至颗粒无收，。目前生产上主要通过化学农药防治和种植抗性品种来控制水稻白叶枯病。与发展新型高效、低毒的农药相比，培育具有白叶枯病抗性基因的水稻新品种是控制水稻白叶枯病蔓延的一种更为经济、有效的途径。据国家水稻数据中心网站（：）统计，截至年月，经国际注册确认和期刊报道的水稻白叶枯病抗性基因共个。其中个为显性基因，其他为隐性基因；已被定位的抗性基因有个，并且、这个基因已成功克隆。在众多的白叶枯病抗性基因中，最为广泛利用的是和基因，由于长期广泛利用，在国内外许多稻区已丧失抗性。章琦等在普通野生稻中鉴定出一个白叶枯病抗性基因，其抗谱较广，抗国内外个白叶枯病鉴别菌株（菲律宾小种、中国致病型小种和日本小种），且完全显性，全生育期抗病，后又将转育到栽培稻中，育成了近等基因系。该基因在杂交稻白叶枯病抗性的改良上具有广阔的前景，。对该抗性基因进行分子标记的开发，提高育种上对抗性基因的选择效率，以迅速地培育出新的抗性品种和推广应用，这是保障该地区水稻生产安全的关键措施。王春连等利用标记，把精细定位于第条染色体上和之间，遗传距离分别为 和 。与基因紧密连锁，在的抗性育种中有很高的选择效率，是目前分子标记辅助选择基因最常用的分子标记；但是由于的产物片段较大，在 以上，在实际应用中不是很方便。结合生物信息学的方法，以的条引物为探针，电子克隆得到的产物序列，设计出一对新的分子标记引物，命名为，并用扩增个水稻亲本和一套中国栽培稻微核心种质材料，研究该分子标记的稳定性和特异性。对含基因的个代育种家系进行了分子标记辅助选择，筛选出纯合的抗性株系。建立的白叶枯病抗性基因的分子标记特异性强，共显性，扩增产物差异大，利用的琼脂糖凝胶电泳即可快速分清等位差异的特点，能快速准确用于抗病基因的辅助选择；利用生物信息学的方法对其他基因分子标记的设计或改良具有一定的借鉴意义。 材料与方法 材料白叶枯病抗性基因供体亲本，两系恢复系“”等核心骨干亲本份（表）；份中国栽培稻微核心种质，种子由中国农业大学李自超课题组提供。该研究中的分子标记辅助选择育种家系是一个包括个代育种家系的三系不育系群体。群体的白叶枯病抗性基因供体是，受体材料为三系不育系天丰和巨风；是抗褐飞虱亲本与白叶枯病抗性基因供体亲本的杂交代群体中筛选出的一个聚合了抗褐飞虱基因、和白叶枯病抗性基因的单株。 方法 生物信息学分析 以标记前后引物序列（： ，： ）为探针，在（：）做序列比对，根据电子克隆到的产物序列重新设计特异性引物。 引物设计与合成 引物设计采用软件 ，引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 水稻基因组提取及扩增和电泳 以植株新鲜嫩叶为材料，采用的提取总。反应体系为 ，含 ， （ ），条 引物各 ， 酶（ ）， 模板， 。反应程序 、 ，然后个循环的 、 ， 、 ， 、 ，最后 延伸 ，扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像系统扫描照相记录结果。 结果与分析 白叶枯病抗性基因分子标记的建立利用标记的条引物在上做序列对比，在粳稻日本晴基因组上第号染色体上比对得到一个 的序列（图），和的片段一致；而这段序列在籼稻“”基因组上对应的位置是一个空白，无法得到序列。因此，只对日本晴中的这段序列进行了分析。结果表明，这序列是基因的基因区的一部分，中间包含一个 的内含子。根据 （ ）的原理，以这段的序列为模板，跨越内含子设计一对内含子多态性引物，序列为： ，： 。在粳稻日本晴基因组中电子克隆产物的长度为 。 分子标记多态性比较以亲本“”、巨风、为模板，用和这个分子标记分别做，用琼脂糖凝胶电泳对比，分别电泳 和 ，分析亲本间的带型差异。当电泳 时，在阴性亲本“”、巨风的带型一致，大约为 ，阳性亲本、一致，大约为 ，阳性和阴性亲本间表现出明显的差异，而在亲本间的差异表现不明显（图）。当电泳到 时在亲本间也开始表现出差异；而此时在亲本间的差异更大，更加容易分型（图）。由此可以看出，和的多态性是一致的，的改良设计是有效的，而且更易分型，便于应用。 分子标记在水稻亲本中的分布利用分子标记检测份水稻资源，除有 条带外，其余份水稻资源均为约 的条带（表），说明分子标记是的特异性标记。为了进一步检测的特异性，检测了在份中国栽培稻微核心种质的多态性分布。中国栽培稻微核心种质是在万多份中国稻种资源中筛选出来的最具代表性的品种，约的品种保存了全部品种的标记多态性和的表型多态性。分子标记检测的结果显示，个品种都显示出清晰的单一条带，其中个品种与“”一致，显示出约 条带；个品种与一致，显示出约 条带。由于来源于野生稻，栽培稻原始品种中不含有该基因，在的品种中与表现出多态性，在籼稻品种中更是超过。因此，在亲本品种间的多态性很高，有很广的适应性。 白叶枯病抗性基因的分子标记辅助选择是基因紧密连锁的标记，前人研究结果表明在选择中选择效率都在以上，有的达到了，有极高的准确度。是的改良型标记，选择效率应该和是完全一样的。因此，用对一个包括个代育种家系的三系不育系群体进行了分子标记辅助选择。在个家系中，筛选出个基因的纯合家系，部分结果如图所示。这个育种家系用抗褐飞虱基因、的分子标记进行检测，得到了个三抗性基因纯合的家系。这些纯合的抗性育种家系为抗病虫育种提供了优良的材料。 小结与讨论该研究目的在于开发白叶枯病抗性基因实用的分子标记，方便对基因的辅助选择。是目前的育种中最常用的标记。但这个标记扩增的产物过大，育种应用实用性较差。该研究结合生物信息学的方法，以的引物为探针，电子克隆得到的产物，序列分析表明，这段产物包括一段内含子序列。前人的研究表明，内含子区域一般承受的选择压力要大大低于外显子区域，内含子变异程度要高于编码序列。引物设计在相对保守的外显子上，比那些引物设计在非编码区域的分子标记类型具有更广的应用范围。因此，利用的方法来改良得到的的标记多态性检测结果也证实了这一点。该研究改良的分子标记具有共显性、带型清楚单一、扩增产物小、阳性与非阳性差异明显、分析容易出带的特点；而且电泳需要时间更短，省时省电，简便高效。在的过程中，短片段的对模板和酶的质量要求都会更低一些，更便于利用。因此，该研究结果大大地改良优化了基因的分子标记；该研究中采用的生物信息学的方法，也将为对其他基因分子标记的设计或改良提供一定的借鉴意义。由于水稻白叶枯病菌致病型的变异，原有的水稻品种已经或正在失去抗性。因此，筛选抗性基因培育新的抗性品种是非常必要的。分子标记辅助选择在水稻白叶枯病抗性育种中已有许多成功的例子，通过研究开发的基因标记，筛选出了多个含有、等多个抗性基因聚合的优良株系，加速了抗性新品种的培育，有利于解决长江中下游地区的水稻白叶枯病抗性问题。参考文献： 中华人民共和国农业部 新中国农业年统计资料 北京：中国农业出版社， ， ， ， ，： 翟文学，朱立煌 水稻白叶枯病抗性基因的研究与分子育种 生物工程进展，（）： 章 琦，王春连，赵开军，等 携有抗白叶枯病新基因水稻近等基因系的构建及应用 中国水稻科学，（）： 章 琦，赵炳宇，赵开军，等 普通野生稻的抗水稻白叶枯病（ ）新基因（）的鉴定和分子标记定位 作物学报，（）： ， ， ， ，： 王春连，戚华雄，潘海军，等 水稻抗白叶枯病基因的标记及其在分子育种上的利用中国农业科学，（）： 李进波，王春连，夏明元，等 分子标记辅助选择基因培育杂交稻抗白叶枯病恢复系 作物学报，（）： 陈建民，付志英，权宝权 分子标记辅助培育双抗稻瘟病和白叶枯病杂交稻恢复系 分子植物育种，（）： 阳海宁，韦绍丽，李孝琼，等 标记辅助培育水稻抗稻褐飞虱和稻白叶枯病基因聚合系 分子植物育种，（）： 于 洁，王耀雯，马文清，等 水稻抗白叶枯病基因群