条斑紫菜(Pyropia yezoensis)10个选育系的ISSR分析.doc

条斑紫菜（Pyropia yezoensis）10个选育系的ISSR分析摘要：利用issr分子标记进行条斑紫菜（pyropia yezoensis）10个选育品系的种质鉴定研究。结果表明，具条带特异性且表达稳定清晰的issr引物共14个，其扩增多态性片段约占97.1%，这些引物可用作区分这些品系的分子标记，同时利用引物826扩增的特异性位点建立了这些选育品系的issr遗传识别码。关键词：条斑紫菜；内部简单序列重复；种质鉴定中图分类号：q945 文献标识码：a doi编码：10.3969/j.issn.10066500.2012.05.005issr analysis of ten breeding lines of pyropia yezoensischen shuyin， lu qinqin， zhang meiru， hu chuanming， xu guangping（marine fisheries research institute of jiangsu province， nantong， jiangsu 226007，china）abstract： inter simple sequence repeat（issr）pcr was used to analyze the genetic variation and germplasm identification of ten different breeding lines of pyropia yezoensis. 14 polymorphic and specifical primers were screened and optimized. from the generated issr products by these primers， 97.1% of the dna bands amplified were polymorphic. these primers could be used as molecular genetic markers to discriminate and evaluate the ten lines. a number of peculiarity amplified bands of primer 826 were applied to establish the issr code patterns of the p. yezoensis ten lines.key words： pyropia yezoensis；issr；germplasm identification条斑紫菜（pyropia yezoensis）为我国长江以北海区主要栽培的大型经济海藻，在经济藻类产业中占有重要地位。随着栽培规模的不断扩大及海域环境变化，条斑紫菜生产面临着产量不稳、产品质量参差不齐及病害频发等的挑战。保护优良种质资源，开发具抗逆性好及生长速度快等性状的新品种、新品系，是当前条斑紫菜产业可持续发展的重要研究课题。为有效实施紫菜种质资源的保护及科学开发利用，国家级紫菜种质库保存有以条斑紫菜为主的大量紫菜原始种质及育种材料，并对优良的野生或栽培品系进行选择、纯化与扩增培育，为紫菜优良种质的研究与有效利用提供丰富的物质基础。由于仅靠条斑紫菜外部形态等特征，难以对同种类的不同来源或不同品系等进行区分。建立有效的分子标记鉴定方法，既可用于种质鉴定，也能用于分析群体的遗传变异、探索辅助育种技术等。内部简单序列重复 （inter simple sequence repeat，简称issr），是zietkiewicz等于1994年创建，是在微卫星标记（ simple sequence repeats，简称ssr） 基础上发展起来的一种标记方法。由于微卫星位点具有普遍的高度变异性，但同一个体又具有稳定的遗传性，通过检测待测样品是否具有目标品种特有的标记指纹片段及其比例，可以有效用于品种鉴定，为育种和种质管理提供了极大的便利。issr标记已广泛应用于多种海藻的遗传作图、生态与进化、分类等；在紫菜种质分析方面也已取得了不少成果，例如，利用该标记分析不同紫菜种类叶状体、坛紫菜不同色泽丝状体鉴定7及野生坛紫菜的遗传多样性等。为研究紫菜种质库选育出的不同品系的分子遗传信息及种质鉴定方法，本试验对10个条斑紫菜选育品系进行了issr引物选择扩增，以期为深入研究利用条斑紫菜种质资源和分子标记辅助育种提供基础数据。1 材料和方法1.1 试验材料选用的10个条斑紫菜选育品系的丝状体样品取自江苏省海洋水产研究所国家级紫菜种质库。1.2 研究方法1.2.1 dna提取 按基因组dna 提取试剂盒（taraka，code：dv811a）说明进行总dna提取。1.2.2 pcr反应条件及电泳检测 pcr扩增采用university of british columbia公布的issr引物（第9套引物），引物序列为上海生工（sangon）合成。在经预选得到的38条引物中再进行优选扩增条带稳定、清晰的引物。为便于规范、快速的检测操作，采用退火温度为52 或54 进行优化反应条件。pcr扩增的25 l反应体系包含：premix ex taq 12.5 l（takara，code：d332a）、模板dna1 l、引物1 l、补去离子水10.5 l。pcr扩增条件经优化确定为94 预变性4 min，然后进行36个循环：94 变性45 s，52 （或54 ）复性45 s，72 延伸2 min，循环结束后72 延伸l0 min。扩增产物在minicell ec350电泳仪上进行检测。dna标准分子量为dl250（takara）。琼脂糖凝胶浓度为1%1.2% （含终质量浓度为0.5 mgl1溴化乙锭），电泳缓冲液为0.5 tbe 硼酸缓冲液；样品加样量为36 l，电压不超过5 vcm1；电泳4590 min 后取出，在紫外分析系统（biorad）上观察结果并拍照记录。1.3 数据处理与统计分析样品pcr产物的电泳图谱中，每一个相同迁移位置的dna扩增带即为同一个位点，赋值为1，无带赋值为0，将dna带的有无转化成（0、1）数据矩阵，确定各样品的特异条带识别码。利用ntsys pc version2.10e软件计算不同个体间的遗传相似性系数（genetic similarity，gs），并据此进行聚类分析，按照非加权组对平均法（unweighted pair group method using arithmatic average，简称upgma）进行聚类分析，构建聚类关系图。2 结果与分析2.1 引物筛选结果试验通过扩增条件优化，从38个引物中筛选出14个引物及其pcr反应体系。所选引物序列及扩增情况见表2。14个引物中，二核苷酸重复的有13个，其中多为 （ca）n和（ag）n重复（占47.2%）。引物可扩增位点的数目在314之间，分子量大小在2503 000 bp之间。14个引物进行pcr扩增共计有137个位点，有133个多态性，多态位点百分率占97.1%。2.2 不同品系的遗传相似性分析对10个品系的pcr扩增结果见图1。这些电泳图谱反映了不同种质间的特异性及亲缘关系。在特异性表达方面，引物807对样品8、引物808对样品10在分子量约为2 250 bp处分别存在3条、2条特征带，再结合引物818及826可把其他紫菜系区分出来；引物817可用于区别诱变组（c组）与其他样品；在引物848的10个样的电泳图中，样品3、4相近有相同条带，同时样品5在1 500 bp附近有两条带，其他样品则没有。借助引物807、808及826共3个引物可以把这10个紫菜系区分出来。从表2分析得出，利用23个具特异性表达的issr引物可把各个种质区分出来，个别品系只用一个引物就可以达到效果。从图谱中反应不同品系间的相似性主要有：（1）13样品为绿色性状品系，在引物817、864下的dna条带相似；样品1、2由同一品种的不同组织得到的无性系，具有极高的遗传相似度，在引物808、817、818、826、827、842、848及864一共8个引物中的dna片段分布相一致。（2）在引物808、817、818、826、842及848的电泳图中，样品6、7有近于相同条带表达。从图中的扩增带说明这些引物用于这些样品的种质鉴定，有许多值得利用的特异性或共性表达结果。2.3 遗传特异性与聚类分析依据引物826对10个样品的扩增位点特异性，以双元数字模式构建10个条斑紫菜系的可计算机化的issrdna指纹谱（表3），可以用输入计算机的10位数字来验证这些紫菜品系。表3中所标分子量为参考范围。把各品系的dna扩增位点有无转化成0、1矩阵，利用软件计算了各紫菜系间的遗传相似性指数（表4）及系统亲缘关系（图2）。从图2可见，样品1与2、样品3与4、样品6与7分别聚在一起。这些试验结果理清了这些样品存在的一些来源与亲缘关系，也为优良品系选育提供进一步的依据。10个样品的遗传相似指数在0.484 00.789 8，说明品系间的亲缘关系皆较为接近，且样品9与10条斑紫菜品系之间的遗传相似指数最高。这些样品主要分为两支，一组为1、2、5号样品，另一组为其他7个样品。5号样为具优良遗传潜力的选育栽培品系，却和1、2号样亲缘关系相对较近，其与1、2样的遗传相似度分别为0.636 9、0.694 2。3 讨 论3.1 不同品系的遗传特性本研究中，1、2样品分别为同一品种的果孢子或组织切片中选育出的培育系，在7个引物的扩增下dna条带基本一致，另外7个引物的条带分布也存在部分相同，这些图谱简单、快速的呈现了两者的亲缘关系。在应用issr引物扩增的10个品系的表达图谱中，反映这些品系间多有较近的遗传距离，原因可能是：选用的10个品系中多是从南通海区的野生品系通过人工诱变或筛选的方法获得，或者利用突变体培育系与原来的野生型杂交后获得的，存在一定的同源性。通过聚类分析得到的品系间亲缘关系可以将10个试验材料分为4组，这与实际品系间关系有一定变化，这是否由于品系来源的祖先亲本存在一些种质混杂，或与物种的繁殖特性有关，有待于进一步研究。陈昌生等8研究表明野生坛紫菜不同地理群体间有较大的基因流（nm=7.193 0）；贺剑云等9分析认为不同来源的试验材料聚类结果比较复杂，与目前的紫菜养殖品种间相互混杂，及海区栽培时不同品种间基因交流的机会大有关，而且选育方法也是导致养殖品种混杂的原因。在条斑紫菜的优良品系选育研究上，如能先就种质遗传信息作进一步研究，建立基于dna的指纹监测，来弥补依据表观特征的不足。另外，要得到审慎、准确的结果，最好能再结合别的特异性标记，如目前dna条型码等技术方法。3.2 dna指纹图谱方法在紫菜种质鉴定中，也有利用其他多个不同分子标记技术建立dna指纹图谱，如rapd10、scar11、ssr12、aflp9，4及rasp14等，这些分子标记方法的应用各有优缺点，关键是如何简化、规范实验操作体系，并且在解决主要问题时具有可操作性及通用性，真正做到简单、快捷、准确可靠。issr标记因其研究特点，被较早应用于分析紫菜种质资源，有较多参考结果；另外，issr标记有一套行之有效的通用引物，只需一般的实验设备就可以开展工作，且其实验操作步骤简单、快捷，结果容易分析。利用issr标记在紫菜种质资源鉴定中有较好的应用前景。参考文献：1 周向红，李信书，阎斌伦，等.条斑紫菜半胱氨酸合成酶基因表达对重金属铅胁迫的响应j.河南农业科学，2011，40（10）：111114.2 zietkiewicz e， rafalske a， labuda d. genome fmgerprinting by simple sequence repeat （ssr） anchored polymerase chain reaction amplificationj. genomics， 1994， 20： l76l83.3 李丽，王海岗，张晓丽，等.ssr分子标记在作物遗传育种中的应用j.山西农业科学，2008，36（3）：1518.4 孙雪， 张学成， 茅云翔， 等. 几种江蓠属海藻的issr标记分析j. 高技术通讯， 2003， 13（9）： 8993.5 李文红， 姚建亭， 王继成， 等. 龙须菜（ gracilaria lemaneiformis） 选育品系及其野生型的issr指纹分析j. 海洋与湖沼， 2005， 36（3）： 241247.6 崔灵英， 许璞， 朱建一， 等. 四种紫菜叶状体的issr分子标记分析j. 中国水产科学， 2006， 13（3）： 371377.7 谢潮添， 纪德华， 陈昌生， 等. issr标记在坛紫菜不同色泽丝状体种质鉴定中的应用j.水产学报， 2007， 31 （1） ： 105111.8 陈昌生，谢潮添，纪德华，等. 野生坛紫菜种群遗传多样性的issr分析j. 水产学报， 2008， 32 （5） ： 717723.9 贺剑云， 何林文， 张辛， 等. 条斑紫菜（porphyra yezoensis）遗传多样性的aflp 分析j. 海洋与湖沼， 2010， 41（4）： 489494.10 梅俊学， 金德敏， 贾建航， 等. 条斑紫菜不同栽培品系的rapd研究j. 山东大学学报：自然科学版， 2000， 35（2）： 230234.11 石金锋， 贾建航， 金德敏， 等. 紫菜无性系特异scar标记的获得j. 海洋学报， 2003， 25（1）：128131.12 胡则辉， 周志刚， 严兴洪. 坛紫菜微卫星d