分子医学概论PPT课件.ppt

分子医学技能 周俊宜 1 2 课程内容 分子医学与分子医学技术相关理论 基本技术 实验 离心技术 电泳技术 层析技术 分光光度技术 基因操作技术 免疫分析技术视频教学 基因奥秘 生命赞歌 PCR技术及应用 免疫反击战等问题式自主学习 分子医学技术的原理和应用 分子医学前沿技术分子医学技术的应用实验 基因诊断 基因鉴定 免疫学检测等实验课题设计 专家讲座 资料查阅 实验设计 分组报告和答辩 3 1 本课程中学生的作业 实验报告 讲座感想等均需写在每位同学的实验记录本中 不能用打印稿或零星纸张 2 请同学们独立完成每一次实验课的作业或实验报告等 部分实验课安排了思考题 需连同实验报告同时完成 3 实验记录本相当于本课程考核试卷 请同学们认真对待 于课题设计报告时由每班学习委员交实验课老师 考核完后由分子医学实验室统一管理 无实验记录本者按缺考处理 注意事项 4 分子医学与分子医学技术 分子生物学实验室安全与环保 视频 21世纪的生命科学 5 Molecularmedicineandmolecularmedicaltechnology 分子医学与分子医学技术 6 7 分子生物学 的成长过程 8 19世纪末 核素 9 1944年确认了遗传的物质基础是DNA 10 1953年JWatson和FCricK提出了DNA双螺旋结构模型 以DNA半保留复制机制 揭示了生物界遗传性状能世代遗传的分子奥秘 11 12 13 1968年 NirenbergM 遗传密码学说 遗传信息 核酸中4种符号 A C G T U 三联体密码 14 1965年 Jacobf基因操纵子 结构基因 调控序列 ABC 15 1972年 P Berg 构建第一个DNA重组分子2种病毒DNA的重组 16 17 1977年 基因工程产品的出现H W Boyer 第一个基因工程产品 SSsomatostatin 人体生长激素释放激素 SS 抑制和调节多种激素的作用 18 19 70年代DNAsequencingGraessmann和Dicumako莫定了用显微注射法转移基因 Grahant等对磷酸钙介导的DNA转移过程进行了详细的研究 使这技术能被普遍接受和应用 80年代PCR技术的出现定点突变的研究与应用 20 80年代的代表性研究领域基因工程产品的开发应用癌基因的发现DNA 蛋白质分子相互辨认人类基因组计划开始酝酿 90年代的代表性研究领域基因诊断技术渐趋成熟基因治疗合法化人类基因计划的启动分子生物学各分支学科的建立与发展 21 从20世纪50年代起 分子生物学领域的研究成果共获得40项诺贝尔医学 生理科学奖 说明分子生物学在生命科学研究中的重要性 22 从基因的角度重新认识疾病 运用基因技术预防和治疗疾病 目前基因技术大多数尚待完善 前景却未可限量 从伦理 道德 法律 社会的角度审视基因技术的应用和对生命的干预 分子医学 MolecularMedicine Molecularmedicineencompassesthediscoveryoffundamentalmolecularcomponentsthatdeterminenormalcellularbehavior thedissectionofaberrantgeneticexpressionorinteraction andthemodulationorcorrectionofthoseaberrationsforthepurposeofdiseasediagnosis treatmentandprevention Thekeydifferencebetweenthemolecularmedicineandthetraditionalmedicineisthattheformerbasesitsunderstandingofthediseasesandoperationsuponamolecularandgeneticlevel 23 1994年2月 美国国立卫生研究院 NIH 卡普 Karp 布罗德 Broder 癌研究 CancerResearch 分子医学的新方向 Newdirectionsinmolecularmedicine 24 1994年9月 Nature 杂志 分子医学研讨会 theseminarofmolecularmedicine 分子医学的挑战 ChallengeofMolecularMedicine 1995年 美国 MolecularMedicine 杂志正式创刊 25 根据Karp等的定义 分子医学的内容包括 发现控制正常细胞行为的基本分子 弄清基因异常与疾病发生的关系 通过检查和纠正这些异常基因对疾病进行诊断 治疗和预防 分子医学与传统医学的主要不同在于前者对疾病的认识和操作都是在分子和基因水平上进行的 26 分子医学研究 研究内容 疾病的分子机理疾病的基因诊断疾病的基因治疗疾病的基因预防 研究技术 基础生化技术核酸技术蛋白质技术细胞技术动物实验技术 前沿技术分子文库技术分子突变谱技术表达谱技术生物信息技术干细胞技术 27 分子医学研究内容 疾病的分子机理从细胞内部的微观生理学和分子生物学水平上寻找病因 疾病的基因诊断单基因疾病的诊断 有遗传倾向的疾病 外原性病原体 疾病的基因治疗体细胞基因治疗 生殖细胞基因治疗疾病的基因预防基因疫苗等 28 探索疾病的原因 是有效治疗疾病的前提 目前 医学对某些还缺少有效的治疗方法 与对病因缺乏深入认识密切相关 基因科学的发展 为人类从细胞内部的微观生理学和分子生物学水平上寻找病因提供了新的思路 1疾病的分子机理 29 尿黑酸症 尿液 接触空气 黑色 常染色体隐性遗传病 tyrosine 尿黑酸 氧化分解 尿黑酸氧化酶 先天性缺乏尿黑酸氧化酶基因表达 1898年 30 1949年波林发现镰刀型细胞贫血症 病人的红细胞为镰刀形 与血红蛋白结构异常相关 镰形红细胞贫血病人Hb HbS 亚基 正常成人Hb HbA 亚基 31 正常血细胞 镰形红细胞 32 美国毕晓普和瓦慕斯等人的研究表明 动物体内的癌基因不是来自病毒 而是由于在动物的正常细胞基因中本来就存在一个庞大的癌基因族 正常情况下这些原癌基因是不活跃的 但当受到病毒入侵或遇到物理 化学等因素作用时 就可能被激活 突变为癌基因 这也就解释了化学污染 吸烟 放射线辐射等因素致癌的原因 33 2疾病的基因诊断 从广义上讲 大多数疾病都可以从遗传物质的变化中寻找出原因 而从技术上看 只要找到了与疾病相关的基因 基因诊断便可实现 基因诊断将成为疾病诊断的常规方法 单基因疾病的诊断 一般可在临床症状出现之前作出诊断 不依赖临床表型 有遗传倾向的疾病 易感基因的筛查 如高血压 冠心病 肥胖等 外原性病原体 如病毒 细菌 寄生虫等引起的传染病 34 地中海贫血症 甲型和乙型血友病 镰状红细胞贫血 Duchenne肌营养不良症 囊性纤维变性病 Southern印迹法 PCR技术 SSO法 RFLP法 35 RLFP分析法 36 37 38 基因鉴定技术 人体细胞有总数约为30亿个碱基对的DNA 每个人的DNA都不完全相同 人与人之间不同的碱基对数目达几百万之多 因此通过分子生物学方法显示的DNA图谱也因人而异 由此可以识别不同的人 所谓 DNA指纹 就是把DNA作为像指纹那样的独特特征来识别不同的人 由于DNA是遗传物质 因此通过对DNA鉴定还可以判断两个人之间的亲缘关系 DNA鉴定技术是英国遗传学家A J 杰弗里斯 1950 在1984年发明的 由于人体各部位的细胞都有相同的DNA 因此可以通过检查血迹 毛发 唾液等判明身分 39 DNA指纹 只要罪犯在案发现场留下任何与身体有关的东西 例如血迹和毛发 警方就可以根据这些蛛丝马迹将其擒获 准确率非常高 DNA鉴定技术在破获强奸和暴力犯罪时特别有效 因为在此类案件中 罪犯很容易留下包含DNA信息的罪证 根据DNA指纹破案虽然准确率高 但也有出错的可能 因为两个人的DNA指纹在测试的区域内有完全吻合的可能 因此在2000年英国将DNA指纹测试扩展到10个区域 使偶然吻合的危险几率降到十亿分之一 40 基因疗法 即是通过基因水平的操作来治疗疾病的方法 目前的基因疗法是先从患者身上取出一些细胞 如造血干细胞 纤维干细胞 肝细胞等 然后利用对人体无害的病毒当载体 把正常的基因嫁接到病毒上 再用这些病毒去感染取出的人体细胞 让它们把正常基因插进细胞的染色体中 使人体细胞就可以 获得 正常的基因 以取代原有的异常基因 接着把这些修复好的细胞培养 繁殖到一定的数量后 送回患者体内 这些细胞就会发挥 医生 的功能 把疾病治好了 3疾病的基因治疗 41 直接法即将外源性功能基因以逆转录病毒 质粒载体或脂质体类包囊 或以裸露DNA的形式直接注入体内 让基因在体内表达 2 间接法即将受体细胞 例如淋巴细胞 骨髓干细胞 皮肤或纤维细胞等 在体外培养导入外源性功能基因 然后把这种经遗传修饰的受体细胞输回或移植入患者体内 让外源基因表达 体细胞基因治疗 生殖细胞基因治疗 以校正生殖细胞的缺陷为目标 所产生的性状可代代相传 42 43 44 异基因脐血干细胞移植治疗手术 78天后 代表肌肉萎缩情况的肌酸磷酸激酶从6800降到一两千 移植前DMD基因第19号外显子缺失 移植后45天 73天两次检测DMD基因均已恢复正常 缺失的19号外显子已经显现出来 全球首例接受基因治疗的神经肌肉遗传病患者经过了79天考验 45 深圳市赛百诺基因技术有限公司研制开发的抗癌新药 重组人p53腺病毒注射液 商品名 今又生 10月16日获得国家仪器药品监督管理局颁发的新药证书 46 糖尿病是患者胰腺不能正常分泌胰岛素 引起血糖过高而至 其死亡率仅次于癌症和心脏病 全世界的糖尿病患者已达数千万人 20世纪初 医生们就采用胰岛素治疗糖尿病 但胰岛素以往主要靠从牛 猪等大牲畜的胰脏中提取 一头牛的胰脏或一头猪的胰脏只能产生30毫升的胰岛素 而一个病人每天则需要4毫升的胰岛素 胰岛素产量远远不能满足需要 1978年 美国化学家W 吉尔伯特研究小组 利用重组DNA技术成功地使大肠杆菌生产出胰岛素 47 干扰素是两位美国科学家在1957研究病毒的干扰现象时发现的一种抗病毒的特效药 干扰素本是我们身体内部少数几种能抵御病毒的天然防御物质之一 是在病毒入侵细胞以后从仍然健康的细胞中自然产生的 但人体内产生的干扰素数量非常小 所以当时生产的干扰素数量很少而十分昂贵 过去 用白细胞生产干扰素 每个细胞最多只能产生100 1000个干扰素分子 而用基因工程技术改造的大肠杆菌发酵生产 在1 2天内 每个菌体能产生20万个干扰素分子 48 1990年沃尔夫 WOff 等发现 将带有甲型流感病毒核蛋白编码基因的质粒注射到小鼠肌肉内 可使小鼠能经受致死剂量的甲型流感病毒的攻击 裸露的DNA通过注射 滴鼻和肠道也进人细胞 并使之获得保护性免疫 这种具有疫苗作用的裸露DNA称之为 基因疫苗 genevaccine 4疾病的基因预防 基因疫苗 整株疫苗 成分疫苗 基因疫苗 49 分子医学研究技术 50 基因 蛋白质 基因表达 经典技术体系 新技术体系 生物信息技术 分子文库技术 突变谱技术 表达谱技术 干细胞技术 51 经典技术体系 52 获取目标基因 PCR法 基因文库法 化学合成法 53 PCR可以把指定的基因片段数量指数放大 染色体 54 核酸检测和鉴定 55 凝胶成像分析系统 核酸蛋白分析仪 56 基因重组和基因表达 分 切 接 转 筛 表 57 58 59 60 61 基因探针与标记 复性 RNA DNA 62 三种印迹技术的比较 63 64 65 后基因组时代的 分子研究技术 66 生物信息技术 67 生物信息学 bioinformation 是一门伴随着基因组研究而产生的交叉学科 广义地说 它是从事与基因组研究有关的生物信息的获取 加工 储存 分配 分析和解释的一门学科 这个定义包含两层意思 即对海量数据的收集 整理以及对这些数据的应用 68 基因组 指的是生物体内的所有DNA 包括它的基因 人类基因组计划要测定的是人体23对染色体中的所有DNA的序列 它由31 647亿个碱基对组成 共有3万至3 5万个基因 换句话说 生命天书是由30多亿个字写成的 如果将这30多亿字排版到一张报纸上 那么大约需要20万页纸才能排完这部巨著 由此可以想见 读取这部巨著所要耗费的时间将是如何的惊人 解读生命的 天书 人类基因组计划 69 随着主要模式生物的基因组测序完毕 在测序基因组之后 功能基因组学 基因功能分析 进化分析 比较基因组分析等 70 分子文库 71 基本策略 构建不同的文库 基于核酸杂交的筛选 基于抗原抗体反应的筛选 72 基因文库 73 噬菌体展示技术 74 75 76 酵母双杂交系统 Gene BindingDomain ActivationDomain UAS DNA mRNA 结合域 激活域 77 BaitProtein PreyProtein 蛋白质相互作用 78 ReporterGene BaitProtein BindingDomain PreyProtein ActivationDomain 双杂交系统 UAS 79 ReportermRNA ReportermRNA ReportermRNA ReportermRNA ReportermRNA 80 突变谱 81 Kamath Nature 2003 421 220 利用RNAi技术阻断了线虫19757个基因中的16757基因 并分析了相应的表型 82 RNAi技术 83 InitiationStep ATP ATP ADP ppi ADP ppi DICER KINASE RdRP 84 EffectorStep siRNAbindingsiRNAunwindingRISCactivation 85 表达谱 86 生物芯片 87 88 Medium densityDNAmicroarrayfluorescenceimages DNAarraywithadistanceof400umofcenter to centerSYBRstainsssDNAprobe Up Cy5 red andFluorX Green stainimmobilizedDNAprobes Right ArrayArea 0 6cmx0 3cm 89 蛋白质组学 2Delectrophoresis 1 2 90 Proteolyticdigestion Proteolyticfragments Pureprotein 2Delectrophoresis Sample MALDI TOF CapillaryElectrophoresisHPLC Aminoacidsequencing Massspectrum Databasesearching LC MS MS 91 92 转基因生物和动物克隆技术 93 转基因生物是指用实验方法导入的外源基因在染色体基因组内稳定整和并能遗传给后代的一类动物 自从1982年Palmiter等首次将大鼠生长激素基因导人小鼠受精卵雄性原核中 获得了个体比对照组大一倍的转基因 超级小鼠 以来 这项高新技术受到各国重视 发展迅速 取得不少突破 全世界已申请的工程动物专利达到80多项 94 囊性纤维变性是一种遗传病 患者体内会产生粘稠的粘液 阻塞肺部 胰腺和消化器官的内部通道 大约有一半的患者活不过30岁 英国PPT公司培育了植入人体基因的克隆羊 羊奶中含有能够治疗囊性纤维变性的人体蛋白 维尔莫特所在的研究所曾向德国一家药厂出售一头这样的转基因羊 获得50万英镑 95 96 分子生物学的最大弱点过于微观化 容易勿视整体 生物遗传受多种内外环境因素的影响 在获得大量微观资料后 必然要回到整体水平进行综合研究 个体与体系 体外与体内 分子医学的社会 伦理问题分子医学与传统医学最根本的区别在于前者可在基因水平上对疾病进行操作 对遗传物质的操作可能引发的后果一开始就是科学界和公众关注的问题 97 早在70年代初 基因重组技术刚开始出现的时候 以美国著名分子生物学家伯格 Berg 为首的11名科学家共同呼吁禁止开展基因工程的研究 并得到了美国国立卫生研究院的赞同 科学家们对自己的研究工作可能产生的严重后果公开唤起公众的注意 这在科学史上还是第一次 说明科学家对遗传物质的操作所取的态度是极其谨慎的 在那以后 利用基因工程技术在大肠杆茵中生产预定的蛋白质分子被证明是无害可行的 因而在80年代以来得到了迅速的发展 但将基因操作直接应用于人类疾病的治疗则与一般的基因工程不可同日而语 现代基因工程的创始人P 伯格 美国 1926 在1960年以敏锐的科学预见力提出一个大胆的设想 是否可以创造出一种人工方法 把外界的遗传基因引入动物体内 以达到改变遗传性状和治疗某些疾病的需要呢 1972年 伯格把两种病毒的DNA用同一种限制性内切酶切割后 再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来 于是产生了一种新的重组DNA分子 首次实现两种不同生物的DNA体外连接 获得了第一批重组DNA分子 这标志着基因工程技术的诞生 伯格因此获得了1980年诺贝尔化学奖 98 高校实验室安全与环保 99 在我国高校实验室安全与环保隐患危机四伏 不可忽视实验室安全与环保的事故屡有发生触目惊心 令人反省 10种类型案例为证 100 1 剧毒品中毒事故 1994年11月北京某著名高校化学系学生朱令铊中毒 暗取证据 网上求医第一例 95年4月才用普鲁士蓝解毒剂 100 残废 1997年 在北大化学系发生同样事情 两个学生被人投毒 因有朱令前车之鉴 治疗及时 很快痊愈 现两人在美国 中毒者陆晨光曾经看过朱令 对其父说 感谢朱令 是她救了我的命 朱令用她的半条命普及了一条医疗常识 101 2 火灾事故 2008年3月13日大火烧毁东南大学10个实验室 有三十多个房间被烧毁 包括10个实验室 现场一位白发苍苍的老师用 无法估计 来形容损失 光是建筑设计院在四楼的设备 可能就值上千万吧 那些没来得及转移的研究成果 软件 设计文档 还有多少毕业同学的论文资料 这些更是宝贝 多少钱都买不来的 102 世界上知名实验室火灾事故 1998年5月美国位于阿卡迪亚国家公园旁的杰克逊实验室火灾 杰克逊实验室每年向全球输出300万只白鼠 用以进行癌症 艾滋病 糖尿病及其他疾病遗传学研究 这次意外大火 供实验用的50万只白鼠被烧死 将降低全球遗传学研究的速度 至少要2 3年时间才能补充这次遭焚烧的白鼠数量 实验室的安全防火非常必要 不仅仅是财物的损失 而且有些损失是无法用时间和金钱弥补的 103 3 化学爆炸事故 1999年太原机械学院 4 29 重大爆炸伤亡事故 太原机械学院化工实验室爆炸 死亡4人