神经病理性疼痛大鼠脊髓背角神经型一氧化氮合酶表达的多样性和相应亚型对PC12细胞NF-kappaB活性的影响.doc

神经病理性疼痛大鼠脊髓背角神经型一氧化氮合酶表达的多样性和相应亚型对神经病理性疼痛大鼠脊髓背角神经型一氧化氮合酶表达的多样性和相应亚型对 PC12PC12 细胞细胞 NF kappa B 活性的影响活性的影响 华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室 武汉 430030 金小高 罗爱林 王金韬 张广雄 王贤裕 李亚文 摘要摘要 目的 目的 研究神经病理性疼痛大鼠脊髓背角神经型一氧化氮合酶亚型的 表达变化 检测相应亚型对 NF kappa B 转录活性 探讨神经型一氧化氮合酶各 亚型的表达变化在致痛机制中的意义 方法 方法 雌性 SD 大鼠 20 只 体重 150 200g 随机分为 2 组 n 10 对照组和 SNI 组 SNI 组于左肢制备坐骨 神经保留性神经损伤模型 SNI 对照组实施假手术 手术前后测定大鼠对机 械刺激产生缩腿反应的次数 术后 11d 痛觉测定后 每组取 3 只大鼠用于灌注 应用免疫组织化学方法检测脊髓 nNOS 的表达 7 只大鼠断头处死后分离 L4 6脊 髓 提取其中 3 只大鼠脊髓的蛋白质 应用抗 nNOS 羧基端抗体和 Western Blot 方法检测 nNOS 的表达 提取其中 4 只大鼠脊髓的 RNA 1 只大鼠脊髓 RNA 进行 RACE PCR 和 Southern Blot 实验检测 nNOS 不同的 mRNA 余下 3 只大鼠脊 髓的 RNA 用于检测 nNOS 的 mRNA 变化 将携带 nNOS 或 nNOS 基因的 pcDNA3 0 表达质粒通过脂质体转染 PC12 细胞后 提取经筛选 PC12 细胞的核蛋白 采用 EMSA 凝胶电泳阻滞实验检测细胞核 NF kappa B 转录活性 结果 结果 SNI 组术后 3d 机械刺激术侧后爪引起缩腿反应的次数高于对照组 P 0 05 nNOS 主要表 达于脊髓背角的 层和 层 Western Blot 结果显示有三种分子量的 nNOS 表达 分别位于 155 135 和 125KD 左右 155KD 的 nNOS 表达的相对灰度 SNI 组高于对照组 P 0 05 135KD 的 nNOS 表达的相对灰度 SNI 组高于对照组 P0 05 RACE PCR 和 Southern Blot 实验证实有三种 nNOS nNOS 和 的 mRNA 表 达 PCR 结果显示存在 nNOS nNOS 的 mRNA PC12 细胞转染 nNOS 后增加 NF kappa B 转录活性 P 0 05 而 nNOS 降低 NF kappa B 转录活性 P 0 05 结论 结论 大鼠脊髓背角有三种神经型一氧化氮合酶 nNOS 和 表达 神经病理性疼痛时 nNOS 表达升高 而 nNOS 降低 由于结构不同 nNOS 增加 PC12 细胞 NF kappa B 转录活性 nNOS 则降低其活性 可能与疼痛 的机制有关 因此可以认为神经病理性疼痛大鼠脊髓背角 nNOS 和 nNOS 的表 达变化可能是致痛机制之一 关键词关键词 神经病理性疼痛 脊髓 神经型一氧化氮合酶 核因子 kappa B The diversities of neural nitric oxide synthase expression in spinal cord of rats with neuropathic pain and their effects on NF kappa B activity in PC12 cells Xiaogao Jin Ailin luo Ping wang Guangxiong Zhang Jintao Wang Yawen Li Department of Anesthesiology Tongji Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology Wuhan P R China 430030 Department of Anesthesiology The people s hospital of Enshi state Enshi P R China Abstracts Objective To observe the diversity and changes of nNOS expression in spinal cord in rat with neuropathic pain and To determine effects of overexpression of nNOS or nNOS on NF kappa B activity and apoptosis in PC12 cells Methods 20 female SD rats weight ranged from 150 to 200g were randomized into two groups control group and Group SNI No any injury was taken in control group Surgery was performed for SNI neuropathic pain model in Group SNI Foot lift response frequency to mechanical stimulation for ipsilateral hindpaw was assessed by 12g and 2g touch stimulator On the 11th day after operation 3 rats from each group were fixed by perfusion for immunohistochemistry to analyse the expression of nNOS Protein from L4 6 spinal cord from other 3 rats in each group were detected with an antibody specific for COOH terminal domain of nNOS using Western blot Total RNA were extracted from ipsilateral L4 6 spinal cord in other 4 rats in each group Rapid amplification of 5 RACE PCR was performed to identify the diversity of 5 terminus of nNOS then southern blot confirmed them RT PCR devised for different 5 terminus of nNOS were amplified to further confirm presence of the diversity of nNOS in mRNA level PC12 cell was transfected with pcDNA3 nNOS or pcDNA3 nNOS respectively Then the nuclear translocation of NF kappa B of PC12 cell was assayed by electrophoretic mobility shift assay EMSA Results Since the 5th day after operation all rats in Group SNI developed a relative unchangeable mechanical allodynia The expression of nNOS was mainly distributed in neurons in and lemanie in dorsal horn Western Blot analysis indicated three kinds of nNOS at 155 135 and 120 KDa were present in rat spinal cord The nNOS at 155 KDa in SNI group increased significantly when compared with control group P 0 05 but vice versa for the nNOS at 135 KDa P 0 05 Rapid amplification of 5 cDNA ends PCR revealed the presence of three different 5 end splices variants of nNOS RT PCR confirmed two variants encoded for the nNOS at 155 KDa one for the nNOS at 135 KDa PC12 cell Transfected with nNOS gene increased nuclear translocation of NF kappa B comparing with null transfectants PC12 cells But overexpression of nNOS in PC12 cell decreased nuclear translocation of NF kappa B when compared with null transfectants cells Conclusion There are at least two kinds of nNOS protein weighted at 155 and 135 KDa e g nNOS and nNOS expressed in rat spinal cord The expression of nNOS increased in spinal cord in rats with neuropathic pain but nNOS decreased nNOS increase nuclear translocation of NF kappa B in PC12 cells but nNOS decreased it The changes of nNOS and nNOS expression in spinal cord may concern with the mechanism leading to neuropathic pain Key words neuropathic pain spinal cord neural nitric oxide synthase nuclear factor kappaB 外周神经损伤可导致神经病理性疼痛 神经型一氧化氮合酶 nNOS 在脊 髓中发挥着重要的致痛作用 研究表明 1 神经病理性疼痛时 痛觉传人神经 元末梢在脊髓中释放大量的谷氨酸 谷氨酸通过激活 NMDA 受体提高痛觉转递 神经元的兴奋性 与此同时 经 NMDA 受体内流的 Ca2 激活临近的 nNOS nNOS 合成的 NO 透过细胞膜弥散致突触前膜加速谷氨酸的释放 促进 疼痛产生 NMDA 受体和 nNOS 在功能上之所以能够相互促进 是因为 NMDA 受体 亚单位 NR2B 和 nNOS 均具有 PDZ 结构域 2 PSD95 PSD95 是一种骨架蛋 白 它具有 3 个 PDZ 结构域 通过 PDZ 与 PDZ 的相互作用将含有 PDZ 结构域 的 NR2B 和 nNOS 联系在一起 2 这是 nNOS 与 NMDA 受体在功能上具有相互 促进作用的结构基础 近来在小鼠的脑组织中发现三种不同氨基端的神经型一氧化氮合酶 分别 为 nNOS 和 2 5 nNOS 是全长的 nNOS 其分子量为 155kDa 其氨基端 包含一个 PDZ 结构域 可以与突触后致密物质 PSD95 的 PDZ 结构域相互 结合 使得 nNOS 可以位于细胞膜上 而 nNOS 和 的分子量分别为 136 125 kDa 它们均不具有氨基端的 PDZ 结构域 不能锚定在细胞膜上与 NMDA 受体形成复合物 不能充分利用经 NMDA 受体内流的钙 它们合成 NO 的能力分别是 nNOS 的 80 和 3 如上所述 神经病理性疼痛大鼠脊髓中 nNOS 对疼痛产生如此重要 并且大鼠和小鼠组织一样存在多种 nNOS 亚型 2 7 但大鼠脊髓中 nNOS 表达的亚型类别以及各类型的表达变化尚不清楚 因此 本研究的目的之一在于明确神经病理性疼痛大鼠脊髓神经型一氧化氮合酶表达 的亚型及变化 由于缺乏 PDZ 结构域 部分 nNOS 亚型处于细胞浆中 合成 NO 的能力显 著下降 PDZ 结构域不仅对 nNOS 亚型合成 NO 的能力有重要影响 而且可能 对 NMDA 受体的功能有重要的调节作用 研究表明 nNOS 生产的 NO 可以亚硝 基化 NMDA 受体的巯基 改变 NMDA 受体的结构 减少钙离子的内流 8 也 有研究表明 在肌萎缩性侧束硬化症 Amyotrophic lateral sclerosis ALS 的 运动神经元中神经丝相互聚集 聚集的神经丝将 nNOS 包裹在胞浆中 nNOS 不能对细胞膜上的 NMDA 受体产生反馈性抑制作用 NMDA 受体活性增强 导致运动神经元受损 9 由此可以推测 如果 nNOS 亚型缺乏 PDZ 结构域而位 于细胞浆 那么将失去对 NMDA 受体的调节功能 介于 PDZ 结构域对 nNOS 亚型的功能有如此重要影响 本实验在明确 nNOS 各亚型表达及变化的基础上 将选择相应的亚型研究它们在功能上的差异 研究表明 组成型 NOS nNOS 和 eNOS 合成的 NO 通过亚硝基化 NF kappa B 的巯基 破坏其构形 可以抑 制 NF kappa B 的转录活性 8 但研究也显示 NO 具有促进 NF kappa B 转录活性 的作用 8 由此可以推测 不同亚型的 nNOS 可能对 NF kappa B 转录活性产生 不同的影响 研究还显示神经病理性疼痛脊髓中 NF kappa B 转录活性加强 增 加 nNOS 和 COX 2 的表达 提高了痛觉传递神经元的兴奋性 促进疼痛产生 10 11 所以 本实验的另一目的在于选择 NF kappa B 转录活性来研究 nNOS 亚型 功能的差异 探讨不同 nNOS 亚型在神经病理性疼痛大鼠脊髓中的致痛机制 1 材料与方法材料与方法 1 11 1 分组和模型制备分组和模型制备 雌性 SD 大鼠 20 只 体重 150 200g 月龄 2 个月 华 中科技大学同济医学院动物饲养中心 随机分为 2 组 n 6 对照组于大鼠左 肢暴露坐骨神经后 随即缝合切口 SNI 组用于制备坐骨神经保留性神经损伤 模型 SNI 暴露大鼠左后肢坐骨神经主干及其分支 胫神经 腓肠神经 腓 总神经 结扎并切断胫神经 腓总神经 保留腓肠神经 缝合手术切口 1 21 2 痛觉测定痛觉测定 使用动态足底触觉测量仪 Ugo basile 公司生产 意大利 测 定大鼠对机械刺激的反应 12g 和 2g 力度的接触刺激分别代表痛觉过敏和痛觉 异常 每个力度共刺激大鼠术侧后爪足底外侧 30 次 分三次实验 每次刺激 10 次 间隔 10min 后再重复实验 计算总的缩腿反应次数 分别于术前 3d 术后即刻 术后 1 3 5 7 9 11d 测定大鼠对机械刺激产生缩腿反应的次数 1 31 3 免疫荧光双标方法测定脊髓免疫荧光双标方法测定脊髓 nNOSnNOS 和和 NeuNNeuN 的表达的表达 术后 11d 测痛后 两组 各取大鼠 3 只 10 水合氯醛 600mg kg 麻醉后 4 多聚甲醛灌注大鼠 分离脊 髓 截取 L4 6脊髓 经多聚甲醛后固定 蔗糖脱水后 冰冻冠状切片 30 m 收集切片于 0 01mmol L 的 PBS 中 应用漂片法进行免疫荧光组化实验 使用抗 nNOS 梭基端抗体 北京中山公司 检测 nNOS 的表达 切片经 0 01 mol L 1 PBS 漂洗 10min 后滴加羊血清孵育 30min 勿洗 加兔抗 nNOS 1 300 R100 6 1507 12 5 Ogura T Yokoyama T Fujisawa H Kurashima Y Esumi H Structural diversity of neuronal nitric oxide synthase mRNA in the nervous system Biochem Biophys Res Commun 1993 Jun 30 193 3 1014 22 6 Huber A Saur D Kurjak M Schusdziarra V Allescher HD Characterization and splice variants of neuronal nitric oxide synthase in rat small intestine Am J Physiol 1998 Nov 275 5 Pt 1 G1146 56 7 Saur D Neuhuber WL Gengenbach B Huber A Schusdziarra V Allescher HD Site specific gene expression of nNOS variants in distinct functional regions of rat gastrointestinal tract Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2002 Feb 282 2 G349 58 8 Stefano GB Goumon Y Bilfinger TV Welters ID Cadet P Basal nitric oxide limits immune nervous and cardiovascular excitation human endothelia express a mu opiate receptor Prog Neurobiol 2000 60 6 513 30 9 Christopherson KS Hillier BJ Lim WA