茶籽饼粕生物发酵蛋白.doc

吉首大学毕业论文 JISHOUUNIVERSITY本科生毕业论文题 目：茶籽饼粕蛋白发酵饲料技术的研究作 者：贾法学 号：20094066048所属学院：化学化工学院专业年级：2009级食品质量与安全指导教师：李加兴 职 称：教授完成时间：2012年12月1日吉首大学教务处制目 录摘 要2关键词2Abstract2Key words2前言21 实验部分31.1 实验仪器和药品31.1.1 实验仪器31.1.2 实验原料41.1.3 实验试剂41.2 实验方法41.2.1 油茶饼粕的制备41.2.2 固态发酵工艺41.2.3 单菌种发酵法初步筛选培养基配方41.2.4 混合菌种配比试验51.2.5 单因素试验51.2.6 正交试验51.2.7 蛋白质含量的测定62 结果分析62.1 不同培养基配方茶籽饼粕发酵后蛋白质含量62.2 混合菌种配比试验62.3 单因素试验72.3.1 接种量对油茶饼粕发酵饲料蛋白质含量的影响72.3.2 发酵温度对油茶饼粕发酵饲料蛋白质含量的影响82.3.3 发酵时间对油茶饼粕发酵饲料蛋白质含量的影响82.4 正交试验结果93 结论9参考文献10摘 要2关键词2Abstract2Key words2前言21 实验部分31.1 实验仪器和药品31.1.1 实验仪器31.1.2 实验原料31.1.3 实验试剂31.2 实验方法31.2.1 油茶饼粕的制备31.2.2 固态发酵工艺31.2.3 单菌种发酵法初步筛选培养基配方41.2.4 混合菌种配比试验41.2.5 单因素试验41.2.6 蛋白质含量的测定52 结果分析52.1 不同培养基配方茶籽饼粕发酵后蛋白质含量52.2 混合菌种配比试验62.3 单因素试验62.3.1 接种量对油茶饼粕发酵饲料蛋白质含量的影响62.3.2 发酵温度对油茶饼粕发酵饲料蛋白质含量的影响72.3.3 发酵时间对油茶饼粕发酵饲料蛋白质含量的影响72.4 正交试验82.4.1 因素水平表82.4.2 正交试验结果83 结论9参考文献9茶籽饼粕蛋白发酵饲料技术的研究贾法指导老师 李加兴（吉首大学化学化工学院 湖南吉首 416000）摘 要：以油茶饼粕为原料，利用生物发酵技术制备茶籽粕蛋白饲料，首先采用单菌种发酵法筛选培养基配方，再通过混合菌种试验确定最佳的枯草芽孢杆菌，酵母菌和黑曲霉配比，在此条件下，研究了接种量、发酵温度和发酵时间等因素对茶籽粕蛋白饲料蛋白质含量的影响，并经正交试验对发酵条件进行优化。试验结果表明，制备茶籽饼粕蛋白发酵饲料的最佳工艺条件为：接种量为12.5%，培养时间为2d，培养温度为30，通过此工艺可将油茶枯饼的蛋白含量从12.68%提高至21.25%。以油茶粕为主要原料，接入混合菌种进行固态发酵，使油茶粕的蛋白质含量得到较大提高，改善油茶粕的适口性和消化吸收率，从而使油茶粕成为一种较好的蛋白饲料资源。关键词：茶籽饼粕；发酵；蛋白质；饲料。Tea Seed Cake Protein Fermented Feed TechnologyJa FaTeacher Li Jiaxing(College of Chemistry and Chemical Engineering, Jishou University, Jishou Hunan, 416000) Abstract: Camellia oleifera seed meal as the main raw material, to access mixed cultures solid-state fermentation, so that the the Camellia meal protein content has been improved greatly improve the Camellia meal palatability and digestion and absorption rate, so that the Camellia meal become a better protein feedresources.The camellia cake dregs as raw material, the use of biological fermentation technology in the preparation of tea seed meal protein feed, the first single strain fermentation method for the screening of culture medium formula, and then through the test to determine the optimum mixed strain of Bacillus subtilis, yeast and Aspergillus niger ratio, under this condition, studied the inoculation, fermentation temperature and fermentation time and other factors tea seed meal protein feed on protein content, and by way of orthogonal test to optimize fermentation conditions. The test results show that, the preparation of tea seed cake protein fermented feed of the optimum process conditions for: inoculum 12.5%, fermentation time was 2D, culture temperature 30 , through this process can be oil-tea camellia defatted cake protein content increased from 12.68% to 21.25%. Key words: tea seed meal; fermentation; protein; feed.前言油茶是指山茶属植物种子中含油量较高、且有一定经济栽培价值的一类植物的总称1,与油棕、油橄榄核椰子并称世界四大木本油料树种2。我国现有油茶栽培面积超过300万公顷hm2，年产油茶籽约96万吨。，年产枯饼榨油后将产生70多万吨茶籽饼粕3-6。茶籽饼粕中含有蛋白质10%20%、粗脂肪0.5%7%、粗纤维15%25%、糖类物质30%60%，是一种营养价值较高的榨油工业副产品。油茶枯饼通过微生物发酵，可将其糖类、纤维素等主要成分高效转化成蛋白质，成为高蛋白饲料的优质原料，可有效缓解油茶枯饼被废弃掉或廉价出口到国外等问题，可提高油茶副产物的综合利用率7-8。本试验以油茶饼粕为原料，利用生物发酵技术制备茶籽粕蛋白饲料，首先采用单菌种发酵法筛选培养基配方，再通过混合菌种试验确定最佳的枯草芽孢杆菌，酵母菌和黑曲霉配比，在此条件下，研究接种量、发酵温度和发酵时间等因素对茶籽粕蛋白饲料蛋白质含量的影响，并进一步经正交试验优化考察范围，确定生物发酵制备茶籽粕蛋白饲料的最佳工艺，以期得到蛋白质含量高，动物适口性好的高品质饲料。目前中国在利用油茶枯饼发酵方面做得较多的专家为钟海雁、 邓桂兰。邓桂兰等9-12开展了利用茶粕生产菌体蛋白饲料的研究， 研究结果表明酵母菌能较好利用茶粕中的营养物质， 并可获得较多的茵体干重。钟海雁等13开展了油茶枯饼固态发酵技术的研究， 研究结果表明黑曲霉、 毛霉、 117产朊假丝酵母、 平菇和紫木耳均能在脱皂油茶枯饼上正常生长， 发酵后，其蛋白质含量有一定程度的提高。单一菌种发酵油茶枯饼可提高蛋白产量， 但比混合菌种发酵效果差， 因混合菌种发酵可多个菌种之间互相补偿缺陷， 进行协同发酵14-16。通过指示菌以及配伍菌种的筛选， 优化出蛋白产量高的混合菌种， 达到提高发酵油茶枯饼蛋白产量的目的。1 实验部分1.1 实验仪器和药品1.1.1 实验仪器ZNJ-80型小型不锈钢粗碎机（北京兴时利和科技发展有限公司）；XA-1固体样品粉碎机（江苏金坛市亿通电子有限公司）；JA-5103N高精度电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）； 101-2AB型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；凯氏定氮装置（天津市泰斯特仪器有限公司。）；粗纤维测定仪、压力蒸汽灭菌器（常州国华电器有限公司）、恒温培养箱（常州国华电器有限公司）、无菌工作台（常州国华电器有限公司），这些仪器你把公司和型号自己填上去。1.1.2 实验原料油茶籽，产于湖南浏阳；油茶饼粕，实验室自制；马铃薯，购自吉首阳光超市；黑曲霉、芽孢杆菌，均由吉首大学资环学院提供；酵母菌，购自吉首阳光超市。1.1.3 实验试剂PDA液体培养基、氢氧化钠、浓硫酸、盐酸、硫酸铵、葡萄糖、硼酸、还有指示剂等等，所用试剂均为分析纯。1.2 实验方法1.2.1 油茶饼粕的制备(1) 脱油：将去壳茶籽于50干燥4h后适当粉碎，称取10g左右茶籽置于滤纸包中，索氏抽提脱脂8h后干燥；(2) 脱毒：将脱油茶籽粕置于80100热水中浸提2h43h，期间不断搅拌，然后用两层纱布过滤，重复上述操作2次3次，将滤渣于5060干燥4h8h，粉碎后过40目筛，即得到油茶饼粕；。1.2.2 固态发酵工艺(1) 菌种活化：将黑曲霉、酵母菌、芽孢杆菌接入营养琼脂斜面培养基中，于30下震荡培养3d进行活化；(2) 扩大培养：将活化后的菌种接种于PDA液体培养基震荡培养10h，备用；(3) 接种：按一定接种量和菌种比例将菌种接种至茶籽饼粕培养基中；(4) 固态发酵：将接种后的茶籽饼粕置于培养箱中在适当温度下发酵。1.2.3 单菌种发酵法初步筛选培养基配方以脱毒油茶粕为主，辅助添加外源氮源和营养因子设计发酵培养基配方，见表1。将黑曲霉在液体培养基上活化后，按10%接种量分别接种到菌种筛选培养基中，30C条件下培养3d后，发酵产品在60C烘干24h，测定其蛋白质含量。表1 培养基配方设计Table 1 Medium formulation design编号配方1未脱毒油茶粕20g，蒸馏水20mL2脱毒油茶粕20g，蒸馏水20mL3脱毒油茶粕18g，硫酸铵2g，蒸馏水20mL4脱毒油茶粕16g，葡萄糖2g，硫酸铵2g，蒸馏水20mL5脱毒油茶粕15g，葡萄糖2g，硫酸铵2g，CaCl2 0.5g，KH2PO4 0.5g，蒸馏水20mL1.2.4 混合菌种配比试验在7个50ml锥形瓶内分别放入20g复合原料，按10%的接种量接种枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌和黑曲霉的混合菌种，置于30条件下发酵48h，以发酵产物粗蛋白质含量为指标确定最适菌种比例，菌种比例见表2。表2 混合菌种配比比例Table 2 Hybrid strain mixture proportioning序号1234567枯草芽孢杆菌酿酒酵母菌黑曲霉1:1:11:1:21:2:11:2:22:1:12:2:12:1:21.2.5 单因素试验(1)(1) 接种量对油茶饼粕发酵饲料蛋白质含量的影响三角瓶中加入20g油茶籽粕培养基于三角瓶中，并分别接入以质量分数为5%、7.5%、10%、12.5%、15%的接种量接入混合发酵菌液，在温度为30的生化培养箱培养箱中培养发酵72小时后，测定发酵产物粗蛋白含量。(2) 发酵温度对油茶饼粕发酵饲料蛋白质含量的影响三角瓶中加入20g油茶籽粕培养基于三角瓶中，以接入10%的接种量接入A步骤中最优质量分数的混合发酵菌种，分别在20、25、28、30、35生化培养培养箱中培养生化培养箱中发酵72小时后，测定发酵产物粗蛋白含量。(3) 发酵时间对油茶饼粕发酵饲料蛋白质含量的影响三角瓶中加入20g油茶籽粕培养基于三角瓶中，以10%的接种量接入混合发酵菌种，在温度为30的生化培养箱中分别发酵按AB步骤接入混合菌种接入量和发酵温度条件下各自培养2d、3d、4d、5d后，测定发酵产物粗蛋白含量。1.2.6 正交试验根据单因素试验结果，对接种量、发酵时间和发酵温度进行三因素三水平的正交试验，进一步优化发酵工艺，正交试验因素水平表见表3。表3 茶籽饼粕发酵饲料正交试验因素水平表Table 3 Tea seed meal fermented feed orthogonal factors level水平因素接种量(%)培养时间(d)培养温度()接种量(%)培养时间(d)培养温度()17.5225210328312.54301.2.6 7 蛋白质含量的测定微量凯氏定氮法。2 结果分析2.1 不同培养基配方茶籽饼粕发酵后蛋白质含量培养基是供微生物生长的养料，优良的培养基能够为微生物生长提供所需营养元素。黑曲霉作为重要的发酵工业菌种，可产生蛋白酶、纤维素酶等，可将茶籽饼粕中的粗蛋白和纤维素物等质分解成碳源和氮源，以供微生物所利用，因此，试验以黑曲霉作为发酵菌种，并以发酵后蛋白质含量作为评价指标，以筛选茶籽饼粕发酵的培养基配方，其结果如图1所示。由图1可知如图1所示，采用配方4：（脱毒油茶粕16g，葡萄糖2g，硫酸铵2g，蒸馏水20mL）发酵的蛋白含量比其他配方的含量高，相对未发酵的茶籽饼粕，蛋白质蛋白的含量从12.86%提高到了提高至18.02%，因此，后续的试验采用配方4作为发酵的培养基。图1 不同培养基配方茶籽饼粕发酵后蛋白质含量Fig.1 Medium formula protein content in the fermented tea seed meal。2.2 混合菌种配比试验图2 不同菌种混合比例茶籽饼粕发酵后的蛋白质含量Fig.2 Different strains mixing ratio of tea seed meal fermented protein content黑曲霉可以产生淀粉酶和纤维素酶，可将茶籽饼粕中的纤维素物等糖类物质质分解成还原糖，而酵母菌可以利用还原糖快速生长，同时芽孢杆菌能产生多种消化酶，帮助动物对营养物质的消化吸收，并可降低饲料中的抗营养因子9；因此，将此三种菌混合接种相互协同进行发酵，不仅可以产生大量的菌体蛋白，而且可以改善蛋白饲料的饲用适口性，提高消化吸收率；试验将三种菌种按不同比例接种至茶籽饼粕培养基中进行发酵,以确定枯草芽孢杆菌、酵母菌和黑曲霉的最佳比例，其结果如图2所示。 由图2可知，枯草芽孢杆菌，酵母菌和黑曲霉的菌种比例对茶籽饼粕发酵后的蛋白质含量有较大影响，其中4号菌种比例如图2所示，菌种比例（枯草芽孢杆菌酿酒酵母黑曲霉）为，即草芽孢杆菌酵母菌黑曲霉为1:2:2时，发酵后蛋白质蛋白含量最高，为18.04%，其他比例发酵后的含量为14%左右因此优选4号菌种比例作为混合菌种的接种比例，并以此混合菌种作为后续单因素试验菌种。2.3 单因素试验2.3.1 接种量对油茶饼粕发酵饲料蛋白质含量的影响图3 接种量对油茶饼粕发酵饲料蛋白质含量的影响Fig.3 Inoculated fermentation of dietary protein content on the Camellia meal接种量对油茶饼粕发酵饲料蛋白质含量的影响见图3。如图3所示，接种量对发酵饲料的蛋白质含量有较大影响；当接种量较小时，微生物生长过程中的延缓期延长，在相同培养周期下产生的菌体蛋白较少；当接种量过大时，因培养基中的营养物质有限，微生物产生竞争性，不利于微生物繁殖生长，且培养至后期可供微生物利用的营养物质不足，其生长繁殖受到阻碍；由图3可知，当接种量为7.5%时，发酵饲料的蛋白质含量最高，达16.04%，因此选择7.5%作为发酵饲料的适宜接种量结果如图3所示，接种量到7.5%时候蛋白含量最高，最高为16.04%，接种量在5%-7.5%之间，蛋白含量递增；接种量到10%之后，蛋白含量保持在15.20左右。2.3.2 发酵温度对油茶饼粕发酵饲料蛋白质含量的影响图4 发酵温度接种量对油茶饼粕发酵饲料蛋白质含量的影响Fig.4 Fermentation temperature of Camellia meal fermentation of dietary protein content微生物都有最适的生长温度，温度会影响其体内所进行的各种生理生化反应，主要表现为两方面，一是随着温度的升高，微生物细胞的生物生化反应和生长速率均加快，二是微生物菌体中的核酸、蛋白质都对温度极其敏感，尤其是蛋白质，过高的温度会使蛋白质初步变性，使得微生物繁殖速度有所降低，但温度过低又会抑制酶的活性，使蛋白质的合成速度降低10, 11；因此控制适宜的发酵温度极其重要。发酵温度对茶饼粕发酵饲料蛋白质含量的影响 温度对茶籽饼粕发酵的影响如见图4所示，。由图4可知，温度对发酵饲料的蛋白的产量含量影响比较大，发酵之后蛋白在温度为28时候含量最高为17.26%，并且随温度的变化向两边递减在所考察的温度范围内，发酵饲料的蛋白质含量随着温度的升高，呈先增加后降低的趋势，当温度为28时，混合菌种生长最好，发酵饲料的蛋白质含量最高。2.3.3 发酵时间对油茶饼粕发酵饲料蛋白质含量的影响 图5 接种量对油茶饼粕发酵饲料蛋白质含量的影响Fig.5 Inoculated fermentation of dietary protein content on the Camellia meal 培养时间对油茶饼粕发酵饲料蛋白质含量的影响 发酵时间对蛋白含量的影响较大见图5，。随着培养时间的增加，微生物的生长大致经历了四个阶段，分别为迟缓期、对数生长期、稳定生长期和衰亡期。由图5可知，如图5所示呈上升趋势当培养至第3天，混合菌种的生长进入稳定期，菌种停止生长，此后发酵饲料的蛋白质含量基本不变，维持在16%左右，为缩短培养周期，提高生产效率，选择3d作为最佳的发酵时间随着时间的增加蛋白含量随着增加，在发酵时间为3天之后，上升趋势渐渐平缓。2.4 正交试验结果通过单因素试验，确立了发酵生产茶籽饼粕蛋白饲料工艺中接种量、发酵温度和发酵时间的最佳水平值，在此基础上，经正交试验进一步优化考察范围，以确立最佳的发酵条件。正交试验结果如表4所示，极值R越大说明该因素的影响效果越大，从实验结果中可以看出，影响蛋白含量的因素为：培养时间培养温度接种量，即培养时间的影响最大，可确定制备油茶饼粕发酵饲料的最佳工艺条件为A3B1C3，即接种量为12.5%，培养时间为2d，培养温度为30；经验证，在此工艺条件下制备的茶籽粕蛋白饲料的蛋白质含量为21.25%。表4 油茶饼粕发酵饲料正交试验结果Table 4 The Camellia meal fermented feed orthogonal test results2.4.1 因素水平表表3 油茶饼粕发酵饲料正交试验因素水平表接种量(%)培养时间(d)培养温度()17.5225210328312.54302.4.2 正交试验结果试验编号接种量(%)培养时间(d)培养温度()空白列D蛋白质含量（%）1111118.502122217.833133320.044212320.015223118.016231218.647313221.258321318.229332117.86K118.790019.92018.45318.123K218.887018.020018.567019.2400K319.110018.847319.767319.4233R0.32001.90041.3141.3003 通过单因素试验，确立了在各个单因素中微胶囊化的最佳水平值。在此基础上，进一步优化考察范围，以便确立最佳的工艺水平条件。试验结果如表4所示。极值R越大说明该因素的影响效果越大；从实验结果中可以看出，影响蛋白含量的因素为：培养时间培养温度接种量；培养时间的影响最大。从实验结果来看，油茶饼粕发酵饲料最佳工艺为：接种量为12.5;培养时间为2天；培养温度为30。蛋白含量为20.95%。3 结论油茶枯饼通过微生物发酵油茶饼粕通过微生物发酵，可将其糖类、纤维素等主要成分高效转化成蛋白质，成为高蛋白饲料的优质原料，可提高油茶枯饼饼粕的价值，单一菌种发酵培养效果比较差，通过多菌种互配提高油茶枯饼的蛋白含量。试验结果表明，发酵培养基的最优配方为脱毒油茶粕16g、葡萄糖2g、硫酸铵2g、蒸馏水20mL，适宜的混合菌种比例(枯草芽孢杆菌酿酒酵母菌黑曲霉)为1:2:2，制备茶籽饼粕蛋白发酵饲料的最佳工艺条件为：接种量12.5%;，培养时间2天d；，培养温度30。，通过此工艺可将油茶枯饼的蛋