小鼠肝脏RNA的抽提纯化与鉴定.ppt

实验二 小鼠肝脏RNA的抽提纯化与鉴定 实验目的 掌握RNA操作注意事项了解鉴定RNA含量和质量的方法了解RNA抽提原理熟悉RNA抽提方法 实验原理 理论基础 真核生物结构基因有内含子基因在转录水平的表达实验原理 四步骤组织或细胞匀浆分离总RNA纯化RNA检测RNA的纯度及完整性 理论基础 真核生物中绝大多数基因有内含子 如直接由基因组克隆目的基因 不利于编码基因的序列分析及体外利用原核细胞表达 提取RNA并逆转录形成cDNA或构建cDNA文库是获取真核生物表达基因的主要手段 检测基因在转录水平的表达 需检测mRNA含量 定量RT PCR是主要方法之一 内含子 外显子 实验原理 抽提RNA的关键在于去除DNA与蛋白质 常用酸性酚法 在酸性条件下苯酚可溶解DNA而不溶解RNA 同时酚又是蛋白变性剂 利用酸性酚试剂加氯仿共抽提 可一步完成细胞的裂解以及蛋白质与RNA的分离 最后利用异丙醇沉淀 即可获得纯化的总RNA RNA产物的鉴定 RNA的纯度与含量用紫外分光光度法检验 高纯度RNA的A260 A280应处于1 6至1 8之间 A260与RNA浓度呈正比 1OD 40 g mlRNA RNA的完整性可通过电泳检测RNA为单链分子 二级结构复杂 需先经甲酰胺变性 再进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳 细胞总RNA以rRNA含量最高 电泳时可观察到18S与28SrRNA两条清晰条带 且亮度之比接近1 2 表明RNA没有发生降解 泳道前缘还可观察到一条较为模糊且亮度较弱的条带 主要由5S 5 8SrRNA与tRNA组成 RNA电泳结果示意图 RNA电泳结果凝胶成像图 取小鼠肝组织匀浆 处死小鼠匀浆 取肝50 100gTrizol1ml 匀浆 RNA纯化操作步骤 加入氯仿0 2ml 剧烈振荡 室温放置10分钟 12000rpm离心15min 取上清 离心后溶液分为三相 即上层的水相 下层的有机相以及中间的变性蛋白 小心吸取上层水相 绝不能有中层蛋白混入 加入异丙醇0 5ml 振荡混匀 室温放置10分钟 12000rpm离心10min 弃上清 加入50 的异丙醇沉淀核酸 异丙醇的用量应与以上所取上清液的体积相当 1ml75 乙醇洗涤沉淀 12000rpm离心5min 重复一次 空气干燥沉淀 溶解于20 lDEPC H2O 留样2 l 其余 70 保存备用 RNA电泳操作步骤 制备琼脂糖凝胶 首先将0 5g琼脂糖溶化于32ml水 冷却至60 加入5 甲醛变性凝胶电泳缓冲液10ml 37 甲醛水溶液9ml 混合均匀并灌制胶板 取1 lRNA溶液 加入甲酰胺 上样缓冲液9 l 95 变性5分钟 迅速冰浴冷却 点样 150V电泳30分钟 紫外灯下观察电泳结果 分光光度法操作步骤 加1 lRNA溶液于0 4mlDEPC H2O 充分混匀 读取260nm与280nm的吸光度数值 操作注意事项 一 因为RNA酶分布广 活性强 且难以失活 使RNA极易降解 操作时应特别注意 高压消毒实验器皿 烤干 以0 1 DEPC过夜处理所有试剂配置用水 并高压消毒 抽提RNA时 应戴手套和口罩 少说话 操作注意事项 二 DEPC是强烈的烷化剂 通过与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制RNA酶活性 是消除外源性RNA酶的主要方法 但CEPC有致癌作用 并具有很强的反应性 因此注意 使用时 不直接接触DEPC处理的器皿和水必须经高压灭菌处理 使DEPC分解后使用 操作注意事项 三 为避免酶蛋白反复冻溶而失去活性 酶制剂溶于50 的甘油中 20