分子生物学PCR技术.doc

第八章 聚合酶链反应技术第一节 聚合酶链反应第二节 常用的PCR衍生技术第一节 聚合酶链反应一、PCR反应原理二、PCR的反应体系三、PCR的反应条件控制四、PCR的基本操作方法五、PCR技术的质量控制一、PCR反应原理1. 原理是体外酶促反应特异地合成一段已知序列的DNA片段的新方法，与细胞内DNA的复制过程相似。前提：一对特异性引物，与待扩增模板两端互补配对的寡核苷酸。PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 。要点: 主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成。变性: DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链分子作为反应的模板退火: 引物与模板互补结合，形成杂交链延伸: 按照模板链的序列以互补的方式依次把dNTP加至引物的3端，Taq DNA聚合酶使杂交双链不断延伸，直至形成新的DNA双链第二轮：变性退火延伸 2. PCR 产物的累积规律设扩增效率为“X”，循环数为“n”，则二者与扩增倍数“y”的关系式可表示为：y=(1+X)n。扩增30个循环即n=30时，若X=100%，则y=230=1073741824(109)若X=80%时，则y=1.830=45517159.6(107)理论值：呈指数增长 10轮 10320轮 10630轮 109 1ng-1g实际值：模板扩增30轮 1ng-10?g3. PCR 产物的累积规律扩增平台期：经过一定的循环周期后需扩增的片段不再随循环次数的增加而呈指数增长。造成PCR进入平台的原因有：引物二聚体和反应亚产物的产生反应体系各组分的消耗（dNTP和Mg2+消耗完毕、Taq酶失活）引物和已扩增的DNA片段间的竞争等PCR的特异性和灵敏性如何？特异性强引物与模板结合的特异性及DNA聚合酶的忠实性灵敏度高指数增长，从pg 可扩增至 mg 水平二、PCR的反应体系1. 模板2. 引物3. 脱氧核苷三磷酸4. 耐热DNA聚合酶5. 镁离子浓度1. 模板(靶基因)DNA mRNA逆转录cDNADNA包括：质粒 噬菌体 基因组DNA较小 较大 目的gene是单拷贝变性较易 变性较难 非常大，变性难较高纯度模板用量 质粒:lng染色体:300 - 500ng理论上50 - 100ng足以满足需要。2. 引物 设计引物应遵循以下原则引物长度： 人工合成短寡核苷酸18bp-25bp Tm=55-60 G+C含量以45%-55%为宜。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶堆积。避免引物本身不要出现内部互补序列形成loop环，内部二级结构如： GGGTCGATTCCTACCCATGC二聚体形成，产生非特异的扩增条带。一般不要超过3个互补bp如：CCCATGC TCAGTAAGCGGGTCTA ATGGAGTC反应体系中引物的浓度一般在0.1 -0.2umol/L。5 端可修饰或突变，但绝不可以在3 端进行上述改造如：32P、生物素、荧光素，不影响其效果3. dNTPdATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致最适浓度：20-200mol/L浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加不稳定，保存时间长会失效Taq DNA聚合酶耐高温变性温度95使其在整个扩增循环中保持足够活性。在7075时具有最高生物学活性。Mg2依赖性酶。缺乏3 5外切酶活性。扩增的片段越长，错配的机率越高50 100ul的反应体系需要1 2.5U酶量。5. Mg2浓度不同的酶需不同Mg2+ ，Mg2+ 对反应影响很大Taq：以1.5-2.0mmol/L终浓度pfu：2.0 -3.0mmol/L，dNTP、primer用量约增加一倍外界影响： EDTA鳌合Mg2+选较低浓度TE(10mmmol/L Tris,1mmmol/LEDTA)；DNA模板、引物和dNTP 的磷酸基团均可与Mg2+ 结合，降低Mg2+1. 变性温度与时间：一般情况下，94-97lmin足以使模板DNA变性。2. 复性温度与时间：Tm值(解链温度)=4(G+C)2(A+T)复性温度=Tm值-(5-10)复性温度越高，扩增特异性越好取决于Tm值：Tm退火T； Tm退火T3. 延伸温度与时间 ：常为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应的时间，则根据待扩增片段的长度而定。?500核苷酸 1min ?500核苷酸3min一般：40-60sec4. 循环次数一般选择25-35次1. 样品的处理目的：暴露核酸 、去掉pr，碎片。方法：经典酚氯仿，简化处理方法。2. 建立一个标准的反应体系 25-100ulMg2+ 1.5mmol/L4种dNTP混合物 各20-200umol/L引物 各0.1-0.2umol/L模板DNA 0.1-2.0ugTaq DNA聚合酶 1.0 -2.5u3. 反应条件循环参数设定4. 产物检测凝胶电泳分析酶切分析直接测序杂交如何完成一个高质量的PCR扩增？建立一个标准的PCR实验室要求： 四区（或三区）隔离，单循环试剂贮存和准备区标本制备区扩增反应区产物分析区假阳性问题：污染产物污染、试剂污染、标本间交叉污染等。防污染的措施严格